二种核酸检测法诊断幽门螺杆菌感染的临床比较

目的:二种核酸检测法诊断幽门螺杆菌(HP)感染的临床诊断价值,用以向临床日常实践中推荐使用。方法:117例胃炎、胃溃疡和胃癌患者胃黏膜活组织标本采用HP恒温扩增-防污染核酸试纸条和实时荧光定量PCR进行HP检测,并比较二种检测方法的特异性、灵敏度等。同时以组织学染色和细菌培养二种"金标准"法作为比较。结果:二种"金标准"法诊断了HP感染的阳性66例,阴性51例;66例"金标准"检测法诊断HP阳性的标本中,其中有62例HP恒温扩增-防污染核酸试纸条检测阳性,60例实时荧光定量PCR检测阳性;51例"金标准"检测法诊断HP阴性的标本中,其中有49例HP恒温扩增-防污染核酸试纸条检测阴性,50例实时荧光定量PCR检测阴性,据此HP恒温扩增-防污染核酸试纸条检测HP的诊断敏感性为93.9%(62/66),特异性为96.1%(49/51);实时荧光定量PCR检测HP的诊断敏感性为90.9%(60/66),特异性为98.0%(50/51)。结论:HP恒温扩增-防污染核酸试纸条和实时荧光定量PCR检测技术相当,但HP恒温扩增-防污染核酸试纸条检测不需要昂贵的仪器设备,结果便于阅读,操作方法简单,适宜于作为HP感染筛查的基础。     

基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增技术检测HIV-1病毒

目的 建立一种基于颜色判定的用于人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)检测的逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术.方法 根据HIV-1 gag基因保守区的序列设计RT-LAMP引物,利用 已建立好的基于羟基萘酚蓝(HNB)颜色判定的RT-LAMP体系验证其灵敏度与特异性,并对实时荧光逆转录PCR(qRT-PCR)确认的临床样本进行一致性对比.结果 RT-LAMP引物特异性高,检出限为1000个拷贝RNA,对43份临床样本检测的灵敏度和特异性分别为94.6％ ～ 100％.结论 基于颜色判定的环介导恒温扩增方法摆脱了对昂贵仪器的依赖,有望应用于HIV-1感染的现场筛选,为快速检测HIV-1病毒提供了新方法和新思路.     

核酸试纸条法检测HBV基因型方法的建立

目的 建立一种快速、肉眼可观测的方法检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型.方法 根据GenBank中已发表的明确HBV分型全序列,设计特异的引物和标记生物素探针,建立核酸试纸条法检测150例乙型患者和20例健康体检者的乙型肝炎基因型,同时采用荧光定量PCR法进行比较.结果 150例标本中B型检出率为34.00%(51/150),C型占61.33%(92/150),B/C混合型占4.00%(6/150),未分型占0.67%(1/150).与荧光定量PCR法进行比较,结果一致.结论 核酸试纸条法检测HBV基因型与荧光定量pCR法相比较灵敏度和特异性相似,但该方法更简便、快速,更适合临床开展.     

实时荧光定量PCR检测泌尿生殖道患者尿液解脲脲原体

目的应用实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）检测泌尿生殖道患者尿液解脲脲原体（UU）,并评价其敏感性和特异性。方法对140例疑似泌尿生殖道感染患者的拭子和尿液样本,分别采用培养法、SAT进行解脲脲原体检测,检测结果有差异的标本用实时荧光定量PCR法对拭子进行复测,根据实验结果评估SAT检测尿液UU的敏感性和特异性。结果 140例疑似患者试子培养和尿液SAT检测阳性率均为60%,两者比较差异无统计学意义（P〉0.05）,其中16例培养结果与SAT检测结果不一致,8例培养法阳性、SAT阴性的拭子PCR结果复测阳性;8例培养法阴性、SAT阳性的拭子标本PCR结果 4例阴性、4例阳性,结合培养法结果和PCR结果作为＂扩大金标准＂,得出SAT对尿液检测的敏感性为95.5%、特异性为100%。结论 SAT检测泌尿生殖道患者尿液UU具有取样方便,检测快速、准确等优点,适用于临床实验室泌尿生殖道UU的检测。     

膜芯片技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和3种支原体的方法学研究

目的建立和评价一个新的多重PCR．反向线点杂交技术（RIJB）快速同时检测泌尿生殖道沙眼衣原体（Ct）、淋病奈瑟菌（坛）和3种支原体感染的方法。方法分别选择Ct隐蔽质粒和Ng16SrRNA基因设计两对特异性引物，以支原体内转录间隔序列（ITS）设计一对支原体属通用引物，生物素标记下游引物。构建三重PCR同时扩增Ct、Ng、解脲脲原体（仇）、微小脲原体（跏）、人型支原体（Mh）等菌DNA，然后与固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交。并对142份经荧光定量PCR（FQ-PCR）检测0和坛的性病高危人群标本，以及45份经支原体液体培养法鉴定的标本进行检测。结果多重PCR可同时扩增Ct、Ng、Uu、Up和Mh标准菌株DNA，其PCR产物的片段长度为208～408bp。97份FQ-PCRCt阳性标本中有93份经多重PCR-RLB检测为Ct阳性，45份FQ-PCRCt阴性标本中35份多重PCR-RLB阴性。41份FQ-PCRNg阳性标本中34份多重PCR-RLBNg阳性，101份FQ-PCRNg阴性标本中98份多重PCR-RLB阴性。其中36份经多重PCR-RLB检测为混合感染。32份支原体液体培养阳性标本中28份多重PCR-RLB阳性，13份支原体培养阴性标本经多重PCR-RLB检测均为阴性。结论多重PCR-RLB可快速同时检测Ct、Ng、Uu、Up和Mh，为性传播疾病的临床诊断提供了一种可靠的方法。     

四种方法检测乙型肝炎病毒基因型的比较

目的 比较四种方法检测乙型肝炎病毒基因型的差异性.方法 对36例乙型肝炎患者的血清分别采用测序技术,荧光定量PCR技术,恒温扩增技术,基因芯片技术进行乙肝病毒基因型的检测.结果 36份血清以测序技术为金标,观测荧光定量PCR技术特异性100%,敏感性83%,恒温扩增技术特异性100%,敏感性89%,基因芯片技术特异性100%,敏感度92%.结论 目前临床采用的四种方法检测乙型肝炎病毒基因型的特异性相同,敏感度以测序为金标准,基因芯片技术最灵敏,其次为恒温扩增技术,最后为荧光定量PCR技术.     

FQ-PCR检测不孕不育患者解脲支原体和沙眼衣原体

目的观察解脲支原体和沙眼衣原体的感染与不孕不育的关系。探讨实时荧光定量PCR技术在不孕不育患者的诊断和治疗中的作用。方法采用实时荧光定量PCR技术检测45对不孕不育夫妇女性宫颈分泌物、男性精液或前列腺标本中的解脲支原体-DNA和沙眼衣原体-DNA含量。结果不孕不育患者解脲支原体-DNA阳性率37.78%,沙眼衣原体-DNA阳性率28.89%,解脲支原体或沙眼衣原体的总感染率为52.22%,正常对照组则分别为15.00%、8.33%、20.00%,两组间有显著性差异。不孕不育组中解脲支原体的感染率明显高于沙眼衣原体（P〈0.05）。女性患者解脲支原体DNA载量和沙眼衣原体-DNA载量均高于男性患者（P〈0.05）。结论解脲支原体和沙眼衣原体是引起男女不孕不育的重要原因之一。荧光定量PCR技术用于诊断引起不孕不育的解脲支原体或沙眼衣原体泌尿生殖道感染是完全可靠的。     

呼吸道合胞病毒荧光纳米颗粒快速检测试纸条检测效能评价

目的评估呼吸道合胞病毒(RSV)荧光纳米颗粒快速检测试纸条的灵敏度和特异性等检测效能。方法以培养的RSV和其他呼吸道病原体以及280例具有上呼吸道感染症状的患者作为标本来源。分别anjiang采用RSV荧光纳米颗粒快速检测试纸条和胶体金快速检测试纸条检测同一份标本,分析两种检测试纸条的检测效能。结果荧光纳米颗粒快速检测试纸条的灵敏度高于胶体金快速检测试纸条;对甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道腺病毒和肺炎支原体无特异性反应。结论 RSV荧光纳米颗粒快速检测试纸条在检测性能上高于胶体金快速检测试纸条。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法。方法根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因（ompA）序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法。结果建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100～107线性关系良好（r2=0.997）,比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00%,阴性符合率为95.09%,总符合率为96.81%。结论建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选。     

恒温扩增试纸条法检测解脲支原体方法的构建及临床应用

生殖道解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)感染是人类生殖道疾病最常见、多发的病原体之一,解脲支原体感染可引起男性泌尿道感染,女性生殖道炎症、盆腔炎等,严重者可引起男女不孕不育[J].早期诊断对解脲支原体感染的治疗有着深远意义.目前实验室检测多以培养和荧光定量PCR为主,而培养需要48 h,同时对标本的采集、运输有较高的要求,不适合于快速诊断.荧光定量PCR技术可以在2h内报告结果,可是需要昂贵的定量PCR仪和标准的实验室才能完成,同时定量PCR仪操作为批量式操作,不能达到随到随检测的目的.本文采用了基因扩增技术和免疫层析技术相结合建立一种新型的检测解脲支原体的方法.现介绍如下.     

环介导的等温扩增与实时荧光PCR检测问号钩端螺旋体的比较

目的 通过比较环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与实时荧光PCR( real-time PCR)技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异,寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法 根据问号钩端螺旋体lipL41基因序...     

双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立

目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌（EHEC）产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

寨卡病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

本研究建立了一种简单、快速、准确的寨卡病毒可视化逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。在线设计3套LAMP引物,利用实时浊度仪筛选最佳引物,加入羟基萘酚蓝,评估可视化RT-LAMP检测方法的灵敏度和特异性。建立的可视化RT-LAMP方法可检测的最低浓度为101copies/μL,高于普通PCR和荧光定量PCR 1~2个数量级;同时,该方法不与其他虫媒病毒产生交叉反应。该方法可为虫媒监测和临床诊断提供实验依据。     

Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing

Real-time PCR has revolutionized the way clinical microbiology laboratories diagnose many human microbial infections. This testing method combines PCR chemistry with fluorescent probe detection of amplified product in the same reaction vessel. In general, both PCR and amplified product detection are completed in an hour or less, which is considerably faster than conventional PCR detection methods. Real-time PCR assays provide sensitivity and specificity equivalent to that of conventional PCR combined with Southern blot analysis, and since amplification and detection steps are performed in the same closed vessel, the risk of releasing amplified nucleic acids into the environment is negligible. The combination of excellent sensitivity and specificity, low contamination risk, and speed has made real-time PCR technology an appealing alternative to culture- or immunoassay-based testing methods for diagnosing many infectious diseases. This review focuses on the application of real-time PCR in the clinical microbiology laboratory.     

Rapid detection of Epstein-Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplification method.

BACKGROUND: The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method is a novel technique for the amplification of specific DNA sequences. OBJECTIVES: To establish the LAMP method for amplifying Epstein-Barr virus (EBV) DNA and to examine its reliability for the detection of EBV DNA in clinical specimens. STUDY DESIGN: Sera from 108 patients, who were initially suspected of primary EBV infection, were tested by the EBV LAMP method, and the results were compared with those of the real-time PCR assay. Serological examination was regarded as the standard diagnostic method. RESULTS: To diagnose primary EBV infection, the sensitivity of LAMP was 86.4% and the specificity was 100%. The sensitivity of the real-time PCR assay was 84.1% and the specificity was 98.4%. Longitudinal analysis showed that the detection rate of EBV DNA in serum by the LAMP method decreased with time in accordance with the decrease of the EBV load. EBV DNA could not be detected in serum 40 days after onset of symptoms. CONCLUSIONS: These results indicate that the sensitivity and specificity of the LAMP method are comparable to those of real-time PCR and that detecting EBV DNA in serum by this method is potentially useful for diagnosing primary EBV infection.     

应用实时荧光PCR法快速检测从业体检人群肠道致病菌结果分析

目的分析与评价实时荧光PCR法快速筛查从业人员沙门菌、志贺菌的带菌情况。方法收集从业人员肛拭样本,用实时荧光PCR法进行快速筛查,采用常规细菌培养法作为标准方法进行验证和血清分型,分析其灵敏度及特异性。结果在24598份样品中,实时荧光PCR法检出沙门菌阳性18份,志贺菌阳性11份．阳性率分别为0．732‰和0．447‰。通过细菌培养法验证及分型,14份标本确认为沙门菌阳性,阳性率为0．569‰,分布于A、B、C、D、E、F6个群11个血清型;6份标本确认为志贺菌阳性,阳性率为0．244‰,分布于B、C、D3个群5个血清型。实时荧光PCR法筛查沙门菌、志贺菌的灵敏度均为100．00％。特异性均为99．98％。结论与传统细菌培养法相比．实时荧光PCR法简便、快速,可提高检测的灵敏度和特异性,减少工作量,适用于肠道致病菌的快速筛查。     

Development of a Sensitive Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay That Provides Specimen-to-Result Diagnosis of Respiratory Syncytial Virus Infection in 30 Minutes

Rapid isothermal amplification methods have recently been introduced, and some of these methods offer significant advantages over PCR. The objective of this study was to develop a rapid and sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification (M-LAMP) assay for the detection of respiratory syncytial virus subgroups A and B (RSV A and B). We designed six primers each for the matrix gene of RSV A and the polymerase gene of RSV B and developed an M-LAMP assay by using a commercially available master mix and a real-time fluorometer (Genie II; Optigene, United Kingdom) that displays real-time amplification, time to positivity, and amplicon annealing temperature (T_m). The M-LAMP was evaluated against PCR by testing 275 nasopharyngeal (NP) specimens. The final optimized M-LAMP assay had a mean amplification time of 14.2 min (compared with 90 to 120 min for PCR) and had an analytical sensitivity of 1 genome equivalent (ge) for both RSV A and B. Using PCR as a comparator, M-LAMP had a sensitivity of 100% (81/81) and specificity of 100% (194/194). We also evaluated a 3- to 10-min specimen processing method involving vortexing with glass beads and heating to 98°C in M-swab medium (Copan Italia, Brescia, Italy) and found that this rapid processing method allowed detection of 37/41 (90.2%) of positives when we used extracted nucleic acid. In summary, the M-LAMP assay had excellent sensitivity and specificity for detecting RSV A and B in NP specimens and, when coupled with a rapid specimen preparation method, could provide a specimen-to-result diagnosis time of 30 min.     

肺炎衣原体及肺炎支原体临床血清学检测试剂的研发及应用

目的 通过实验获得工程重组肺炎支原体和肺炎衣原体的抗原,探讨其临床诊断价值;分析儿童肺炎支原体和肺炎衣原体的发病情况.方法 采集医院收治的社区获得性肺炎患儿的血标本进行肺炎支原体和肺炎衣原体检测,并通过PCR方法得到肺炎衣原体的特异性抗原Cpn-MOMP和Cpn-CPAF和肺炎支原体P1-C和P1-B基因片段,应用工程重组抗原进行肺炎衣原体抗原特异性及灵敏度检测和肺炎支原体的灵敏度实验.结果 肺炎支原体及肺炎衣原体感染的阳性率随着年龄的增长而增加,肺炎衣原体冬季发病率较高.PCR方法可以得到完整的Cpn-MOMP和Cpn-CPAF基因片段,且Cpn-MOMP重组抗原产量高特异性较好.重组肺炎支原体P1-C和P1-B抗原产量较满意.结论 肺炎支原体及肺炎衣原体感染阳性率逐年升高,通过重组的Cpn-MOMP和Cpn-CPAF抗原可用于肺炎衣原体感染的血清学检测,具有临床应用前景.