豚鼠椭圆囊斑微纹区和边缘区毛细胞损伤后恢复的比较观察

利用扫描电镜和连续半薄切片的观察，对豚鼠椭圆囊斑微纹区和边缘区的毛细胞损伤后的恢复情况进行研究。结果，正常豚鼠的椭圆囊斑微纹区的感觉细胞主要是Ⅰ型毛细胞，连续１２天皮下注射庆大霉素（１００ｍｇ／ｋｇ），豚鼠椭圆囊斑的损伤主要发生在微纹区，损伤后较长存活期实验组豚鼠的椭圆囊斑微纹区中，形态类似Ⅱ型毛细胞的感觉细胞占绝大多数。提示这些类似Ⅱ型毛细胞的感觉细胞是修复过程中产生的毛细胞。     

豚鼠椭圆囊斑静纤毛间的相互连接形式

目的：探讨豚鼠椭圆囊斑毛细胞静纤毛束间的相互连接形式及其生理意义。方法：用扫描电镜和透射电镜观察豚鼠椭圆囊斑毛细胞静纤毛束间相互连接。结果：豚鼠椭圆囊斑毛细胞静纤毛束间存在３种相互连接形式：①顶部连接：自短纤毛顶至长纤毛的上行连接;②侧连接：同行静纤毛间的云雾状连接;③行间连接：邻近行间的连接。结论：３种连接的存在可将纤毛束连为一体。推测当纤毛偏转时,所有静纤毛可能形成一个整体依次移动,牵拉或放松     

庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞破坏后再生及功能恢复

为探讨哺乳动物前庭毛细胞破坏后能否再生及前庭功能能否恢复，以豚鼠为研究对象。实验组动物每日给予庆大霉素皮下注射，连续１０天，对照组动物给予等量生理盐水。于停药后的第２、４、１２和２４周分别处死动物，扫描电镜观察发现，停药２周椭圆囊和壶腹嵴毛细胞破坏最明显的区域可见到不成熟的毛细胞纤毛丛，至停药２４周后继续存在。与对照组相比，停药１２周毛细胞密度下降明显（Ｐ〈０．０１），停药后２４周时毛细胞密度较１     

实验动物前庭感觉毛细胞的定量观察

目的 测量常用实验动物内耳前庭感觉区的实际面积和量化分析前庭各个感觉区的毛细胞总数或密度。方法 ①制作CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西兰白兔和非洲黑长尾猴的球囊斑铺片和椭圆囊斑铺片及壶腹嵴铺片,所有铺片样品来自每种受试动物的6个颞骨,在放大100倍的光学显微镜下拍摄2个囊斑铺片的整体照片;②应用Image J软件的图像测量程序,测量了上述7种常用实验动物球囊斑和椭圆囊斑的实际面积;③用网格将球囊斑铺片和椭圆囊斑铺片照片上的前庭感觉区划分为一个个方块区域。在放大400倍的光学显微镜下准确计数每个方格内的毛细胞数量,然后将每个方格的毛细胞计数结果相加以获得每种受试动物球囊斑和椭圆囊斑上的毛细胞总数;④应用前庭小视野定量观察技术计算出前庭各个感觉区小视野范围内的毛细胞密度。结果 ①从小鼠、裸鼠、大鼠、豚鼠、南美栗鼠、白兔到猴的球囊斑面积依次为(0.193±0.009)、(0.216±0.008)、(0.323±0.010)、(0.528±0.035)、(0.687±0.065)、(1.237±0.075)、(1.371±0.032)mm²;椭圆囊斑的面积依次为(0.193±0.020)、(0.208±0.013)、(0.321±0.011)、(0.526±0.034)、(0.795±0.017)、(1.224±0.082)、(1.388±0.048)mm²;②从小鼠、裸鼠、大鼠、豚鼠、南美栗鼠、白兔到猴的球囊斑毛细胞的总数依次为(2476.3±64.4)、(2389.8±47.8)、(3135.3±191.6)、(4882.2±208.7)、(6128.5±242.9)、(10572.2±464.4)、(10992.7±397.4)个;椭圆囊斑毛细胞的总数依次为(2491.4±54.8)、(2368.0±46.1)、(3218.8±82.9)、(4925.3±271.1)、(7794.0±386.1)、(11347.4±435.7)、(11114.5±410.6)个;③从小鼠、大鼠、豚鼠、南美栗鼠、白兔和猴的球囊斑微纹区和周边区的毛细胞密度(毛细胞数量/0.007mm²)依次为101.0±5.79(微纹区)/120.8±4.15(周边区),95.5±3.91(微纹区)/109.2±5.26(周边区),78.4±6.54(微纹区)/94.8±4.38(周边区),60.0±4.74(微纹区)/84.6±2.61(周边区),57.2±3.83(微纹区)/80.0±3.54(周边区),53.8±4.21(微纹区)/68.0±4.18(周边区)。从小鼠、大鼠、豚鼠、南美栗鼠、白兔和猴的椭圆囊斑微纹区和周边区的毛细胞密度(毛细胞数量/0.007mm²)依次为103.8±5.02(微纹区)/119.2±3.70(周边区),91.2±2.49(微纹区)/106.4±4.16(周边区),74.1±3.54(微纹区)/90.8±3.56(周边区),60.4±4.98(微纹区)/81.6±2.07(周边区),57.8±1.92(微纹区)/77.8±3.70(周边区),54.0±2.74(微纹区)/66.4±2.51(周边区)。从小鼠、大鼠、豚鼠、南美栗鼠、白兔和猴的壶腹嵴毛细胞密度(毛细胞数量/0.007mm²)依次为112.4±6.38,105.5±3.51,95.2±3.42,84.0±7.16,78.2±2.86,70.8±2.39。可见由于体型较小动物毛细胞的细胞体比体型较大动物毛细胞的细胞体小,因而体型较小动物的前庭毛细胞密度高于体型较大动物的前庭毛细胞密度。另外,每种实验动物球囊斑和椭圆囊斑微纹区的毛细胞密度相似,周边区的毛细胞密度也大致相同,但是同种实验动物囊斑微纹区的毛细胞密度却低于周边区的毛细胞密度。此外,壶腹嵴毛细胞的密度与球囊斑和椭圆囊斑周边区的毛细胞密度几乎相同。鉴于某些损害因素往往具有选择性破坏囊斑微纹区毛细胞的表现,因此囊斑微纹区的毛细胞密度应该与囊斑周边区的毛细胞密度区分开来进行统计,必要时甚至需要把Ⅰ型毛细胞和Ⅱ型毛细胞也区分开来分别予以病理学改变的定量评估。结论 本研究采用的前庭测量方法和获得的前庭各个感觉区的测量数据和毛细胞总数及毛细胞密度,为前庭病理学研究的定量分析提供了有益的参考经验和必要的参考数据。     

庆大霉素耳中毒后豚鼠椭圆囊斑和耳蜗毛细胞损伤与再生的观察

庆大霉素耳中毒后豚鼠椭圆囊斑和耳蜗毛细胞损伤与再生的观察刘冰李西秦吴润身王锦玲刘顺利哺乳类动物内耳毛细胞损伤后能否再生和修复受到广大学者的关注。我们采用扫描、透射电镜和听性脑干反应（ＡＢＲ）对豚鼠椭圆囊斑和耳蜗毛细胞在庆大霉素损伤后的再生和修复能力进...     

碱性成纤维细胞生长因子对豚鼠椭圆囊毛细胞再生的影响

目的 利用豚鼠椭圆囊培养的方法观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对毛细胞再生的影响。方法 应用新霉素破坏豚鼠离体椭圆囊毛细胞,实验组培养液含有bFGF,对照组培养液则不含有bFGF。培养18d后两组均行扫描电镜检查,并行新生毛细胞计数,比较两组新生毛细胞数目的差异,观察bFGF对椭圆囊毛细胞再生的影响。结果 实验组新生毛细胞数目明显多于对照组(P<0.05)。结论bFGF对椭圆囊毛细胞的再生有促进作用。     

慢性庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮细胞的凋亡和再生观察

目的：观察慢性庆大霉素中毒后豚鼠前庭上皮的损伤和修复过程，探讨前庭毛细胞凋亡和再生的关系。方法：采用末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terninal deoxyuncleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL）法，观察前庭感觉上皮细胞的凋亡，采用5′-溴-2-脱氧尿苷（bromodeoxyuridine，Brdu）免疫细胞化学法观察前庭上皮的再生过程。结果：对照组没有观察到TUNEL和Brdu阳性细胞。停止庆大霉素注射1天至3周均可观察到TUNEL阳性细胞，但1天组阳性细胞数量最多，3周仍有阳性细胞存在，阳性细胞主要位于毛细胞层。停止庆大霉素注射后1天组支持细胞层和毛细胞层均有Brdu标记阳性细胞，3d组支持细胞层阳性细胞显著增多，1周组毛细胞层也出现较多阳性细胞，2周组Brdu标记阳性细胞主要位于毛细胞层，3周仍可观察到Brdu标记阳性细胞。结论：慢性庆大霉素耳中毒后豚鼠前庭上皮细胞凋亡增加，凋亡与增殖伴随存在，前庭毛细胞的损伤可能是其增殖的触发因素。增殖过程表现为支持细胞增生向毛细胞增生移行的趋势，支持细胞增殖并转化成毛细胞可能是前庭上皮细胞损伤修复机理之一。     

豚鼠前庭感觉上皮损伤中细胞凋亡的观察

细胞凋亡对细胞增殖、器官发生和功能维持起着重要作用。一定剂量的庆大霉素连续注射，造成豚鼠前庭器官损伤。采用半薄切片，透射电镜（ＴＥＭ）和ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ－ｍｏｄｉｄｅｄ ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ，末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素标记）原位杂交技术，特异标记ＤＮＡ片段３＇－ＯＨ末端，原位显示凋亡细胞。在半薄切片和ＴＥＭ观察中发现两种类型的细胞损伤方式：①毛细胞肿胀     

卡那霉素耳中毒后鹌鹑耳蜗毛细胞损伤与再生的观察

４０天龄鹌鹑连续１０天肌注卡那霉素造成耳中毒后，分别于停药后１天或１、２、３、４和６周进行听神经动作电位测试及扫描电镜观察。发现停药后１天动物毛细胞大量破坏，听功能严重受损，同时还出现了新生毛细胞。随着时间推移，新生毛细胞逐渐增多，听功能也随之改善，直至停药后第６周耳蜗形态基本恢复正常时，高频听阈仍明显高于对照组。本实验结果表明，鹌鹑听毛细胞受损后几乎可完全再生，而且再生毛细胞具有感音功能，但功能改善明显迟于形态恢复。     

豚鼠耳蜗毛细胞暴露非聚焦超声后的酶组织化学观察

目的 探讨非聚焦超声（non-focused ultrasound,NFU)对耳蜗毛细胞的影响。方法 以A型超声波诊断仪为超声发射器，分别以2.5MHz、8MHz照射各15耳豚鼠耳蜗6h后30min和8h行耳蜗基底膜毛细胞铺片及冰冻切片观察琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH)组织化学变化。结果 2.5MHz、8MHz NFU照射豚鼠耳蜗6h后8h能引起不同节段基底膜毛细胞SDH酶活性降低，其中外毛细胞较内毛细胞SDH酶活性降低更甚。照射后8h组较照射后30min组SDH酶活性有明显恢复。结论 不同频率NFU超声照射耳蜗达一定剂量可以引起不同部位基底膜毛细胞的病理性缺氧改变，而这种缺氧病理改变在一定暴露剂量下是可逆或部分可逆的。提示耳蜗毛细胞可能与超声感受有关，其中外毛细胞可能起更为重要的作用，且不同部位毛细胞与超声感受的频率选择性可能有一定关系。     

豚鼠耳蜗毛细胞暴露非聚焦超声后的酶组织化学观察

目的　探讨非聚焦超声 (non focusedultrasound ,NFU)对耳蜗毛细胞的影响。方法　以A型超声波诊断仪为超声发射器 ,分别以 2 5MHz、8MHz照射各 15耳豚鼠耳蜗 6h后 30min和 8h行耳蜗基底膜毛细胞铺片及冰冻切片观察琥珀酸脱氢酶 (succinatedehydrogenase ,SDH)组织化学变化。结果　 2 5MHz、8MHzNFU照射豚鼠耳蜗 6h后 8h能引起不同节段基底膜毛细胞SDH酶活性降低 ,其中外毛细胞较内毛细胞SDH酶活性降低更甚。照射后 8h组较照射后 30min组SDH酶活性有明显恢复。结论不同频率NFU超声照射耳蜗达一定剂量可以引起不同部位基底膜毛细胞的病理性缺氧改变 ,而这种缺氧病理改变在一定暴露剂量下是可逆或部分可逆的。提示耳蜗毛细胞可能与超声感受有关 ,其中外毛细胞可能起更为重要的作用 ,且不同部位毛细胞与超声感受的频率选择性可能有一定关系     

顺铂损伤后幼年斑马鱼侧线毛细胞STAT3的表达及意义

目的建立斑马鱼侧线神经丘的顺铂损伤模型,检测STAT3基因的表达情况,探讨其在毛细胞顺铂损伤过程中所发挥的作用,为抗顺铂耳毒性的研究提供理论依据。方法将受精后5天的斑马鱼幼鱼利用250μM顺铂溶液浸泡3小时建模,通过Yo-pro-1荧光染色、TUNEL染色了解毛细胞损伤情况,利用RT-q PCR、原位杂交等技术检测STAT3基因的表达改变。结果使用250μM顺铂溶液浸泡斑马鱼幼鱼3小时,可使其侧线神经丘毛细胞数降低(P<0.001),可诱导侧线神经丘出现细胞凋亡(P<0.001),且在此过程中,STAT3基因的表达出现上升(P<0.001)。结论STAT3在顺铂对斑马鱼侧线神经丘毛细胞的损伤过程中可能与毛细胞凋亡相关并扮演一定角色。STAT3表达的升高与细胞凋亡的升高同时发生,表明STAT3在一定条件下可能存在促凋亡的作用。     

卡那霉互耳中毒后鹌鹑耳蜗毛细胞损伤与再生的观察

４０天龄鹌鹑连续１０天肌注卡那霉素造成耳中毒后，分别于停药后１天或１、２、３、４和６周进行听神经动作电位测试及扫描电镜观察。发现停药后１天动物毛细胞大量破坏，听功能严重受损，同时还出现了新生毛细胞。随着时间推移，新生毛细胞逐渐增多，听功能也随之改善，直至停药后第６周耳蜗形态基本恢复正常时，高频听阈仍明显高于对照组。本实验结果表明，鹌鹑听毛细胞受损后几乎可完全再生，而且再生毛细胞具有感音功能，但功能     

铜绿假单胞菌感染小鼠中耳后对耳蜗及毛细胞损伤的观察分析

目的 探讨铜绿假单胞菌（PA）感染小鼠中耳后对内耳及毛细胞的损伤。方法 选取出生后6～8周的健康CBA小鼠,分为对照组（PBS种植组）和PA左侧中耳种植组,每组小鼠再分为PBS/PA种植后饲养3天组、7天组、14天组;使用耳内镜、小动物体内成像系统、免疫荧光等方法对小鼠中耳、内耳感染情况及耳蜗毛细胞的损伤情况进行观察分析。结果 PA感染中耳后3天、7天、14天中耳腔出现不同程度的黏膜充血水肿,鼓膜穿孔及积脓等化脓性中耳炎的症状;圆窗可见颗粒样物质沉积;小动物体内成像检查可检测到部分耳蜗出现PA感染信号;免疫荧光染色及细胞计数发现,PA感染后7天底转毛细胞计数88.33±66.40,感染后14天小鼠底转、中转毛细胞计数分别为85±33.45,166±33.41,均出现不同程度的缺失,与PBS对照组比较差异显著（P值均小于0.05）。结论 PA感染小鼠中耳后细菌及其产物可进入内耳并引起耳蜗毛细胞的损伤;引起毛细胞损伤的可能是PA的慢性毒性。     

豚鼠前庭椭圆囊器官在庆大霉素损伤后离体培养的细胞增殖

目的 在离体状态下对豚鼠前庭椭圆囊器官进行培养,观察庆大霉素损伤毛细胞后细胞的增殖情况。方法采用白色健康豚鼠36只,体重300-450克,随机分为4组:(1)正常对照组;(2)正常加BrdU(5-溴基脱氧尿核苷BrdU)组;(3)庆大霉素组;(4)庆大霉素加BrdU组。应用体外组织培养、5—溴基脱氧尿核苷(BrdU,3μg/ml)掺入及免疫组织化学染色和Epon树酯包埋半薄切片等方法,在不同时间(2、3、5、15天)光镜观察庆大霉素(2.0mM)损伤后毛细胞及支持细胞增殖情况。结果 用庆大霉素48小时后,可见到椭圆囊感觉上皮中的毛细胞溶解破坏。加入BrdU继续培养,BrdU免疫组织化学染色显示了第5和15天被BrdU标记的阳性细胞核,阳性细胞核多位于椭圆囊感觉上皮中基底层,从细胞的形态和分布位置上看为支持细胞;感觉上皮的表层,也可观察到BrdU反应阳性的上皮细胞,细胞核较圆,形态和位置类似毛细胞。结论 提示损伤后的椭圆囊感觉上皮支持细胞可以进行细胞的有丝分裂,支持细胞可能是修复毛细胞的前体细胞。     

内质网应激反应对豚鼠脑缺血再灌注后听皮质区损伤的作用

目的　观察豚鼠脑缺血再灌注后需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE1）、X盒结合蛋白1(Xbox binding protein 1,XBP-1）在其听皮层的反应以及血 液中C反应蛋白（C reactive protein,CRP）和免疫球蛋白(immunoglobulin M,IgM）的变化,探讨内质网应激及血液免疫反应在脑缺血再灌注后听皮层神经元凋亡中的作用。方法　选取健康豚鼠20只,随机分为5组,每组各4只,分别为正常对照组、缺血15 min组、缺血再灌注6 h组、缺血再灌注24 h组及缺血再灌注7 d组。后四组在相同条件下采用夹闭双侧颈总动脉的方法来建立脑缺血再灌注损伤模型,对照组不予手术。缺血15 min组术后马上行听性脑干反应(ABR)测试,其余实验组待再灌注至对应的时间点后行ABR测试。心脏采血酶标记免疫吸附 (enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）检测血液CRP和IgM的浓度。断头取脑用免疫组织化学的方法测定IRE1、XBP-1表达。结果　ABR测试对照组为（10.0±2.47）dB SPL,缺血15 min组为（15±1.56）dB SPL,缺血再灌注6 h组为（30±2.03）dB SPL,缺血再灌注24 h组为（30±1.67）dB SPL,缺血再灌注7 d组为（15±1.14）dB SPL。缺血再灌注6 h组与24 h组行t 检验,无显著统计学差异,其余各组行方差分析,均有统计学差异（F =170.631,P <0.01）。ELISA法检测CRP对照组为（1198.96±50.81）μmol/ml,缺血15 min组为（1270.70± 34.76）μmol/ml,缺血再灌注6 h组为（1467.80±73.67）μmol/ml,缺血再灌注24 h组为（1352.83±175.71）μmol/ml,缺血再灌注7 d组为（1252.56±41.32）μmol/ml。各实验组行方差分析均有统计学差异（F =6.564,P <0.01）。IgM对照组为（987.32±39.13）μmol/ml,缺血15 min组为（1064.90±39.78）μmol/ml,缺血再灌注6 h组为（1118.03±57.75）μmol/ml,缺血再灌注24 h组为（1122.43±55.40）μmol/ml,缺血再灌注7 d组为（1010.70±55.95）μmol/ml。缺血再灌注6 h与24 h组行t检验无显著差异,其余各组行方差分析均有统计学差异（F =7.413,P <0.01）。HE染色显示各实验组凋亡细胞数 目不等,对照组为2.6±1.13,缺血15 min组为14.1±2.71,缺血再灌注6 h组为24.9±2.20,缺血再灌注24 h组为19.3±1.46,缺血再灌注7 d组为9.4±1.17。各实验组行方差分析均有显著差异（F =109.666,P <0.01）。免疫组化结果显示各组IRE1、XBP-1均有显色。 IRE1阳性颗粒数对照组为9.4±1.56,缺血15 min组为25.6±1.58,缺血再灌注6 h组为60.3±1.57,缺血再灌注24 h组为42.2±2.13,缺血再灌注7 d组为18.3±1.59;各实验组行方差分析均有显著差异（F =709.750,P <0.01）;XBP-1阳性颗粒数对照组为10.6±1.24,缺血15 min组为24.2±1.52,缺血再灌注6 h组为61.4±1.7,缺血再灌注24 h组为41.1±2.38,缺血再灌注7 d组为18.9±1.59;各实验组行方差分析均有显著差异（F =682.737,P <0.01）;IRE1与细胞凋亡率成正相关（r =0.947,P =0.000）;XBP-1与细胞凋亡率成正相关 （r =0.933,P =0.000）;CRP与IRE1成正相关（r =0.747,P =0.000）;CRP与细胞凋亡率成正相关（r = 0.755,P =0.000）;IgM与IRE1成正相关（r=0.695,P =0.000）;IgM与细胞凋亡率成正相关（r =0.765,P =0.000）。结论　在脑缺血再灌注损伤中,听皮层组织IRE1α、XBP1蛋白高表达,提示内质网应激参与了脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的发生发展,IRE1α和XBP1介导的信号转导通路是内质网应激导致脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的机制之一,脑缺血导致的听觉受损又有可能引起血液免疫学改变,内质网应激反应激发并加强了免疫炎性反应。