人类角膜基质细胞研究进展

人角膜基质细胞存在于角膜基质层中,在正常状态下为静止状态,呈扁平、树枝状,在维持角膜透明性中起重要作用,细胞间通过间隙连接进行物质和信息交换。就角膜基质细胞的分布、不同表型、功能及其与角膜疾病的关系作了综述。     

兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性

目的 改进兔角膜基质细胞培养技术，观察其生物学特性。方法 先同时消化角膜上皮及内皮层，然后刮去上皮，内皮，前弹力和后弹力层，接着将剩余的基质层剪碎消化，接种，采用MTT法观察细胞生长情况，并对比有，无血清培养基对细胞生长的影响。结果 角膜基质细胞10d后形成细胞单层，增殖旺盛，有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰，无血清培养基培养的细胞生长较慢，第9天左右达到生长高峰，结论 改进的角膜细胞培养技术简便，成功率高，培养出的角膜基质细胞生长良好，血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。     

角膜基质细胞体外长期培养过程中生物学特性的改变

目的 研究兔角膜基质细胞在体外长期培养传代过程中,细胞增殖能力和胞外基质表达水平的改变。方法 取体外培养兔角膜基质细胞,由光镜对各代细胞的形态学变化进行观测。通过对各代细胞生长曲线的绘制,得出其各自的群体倍增时间;MTT法比较各代细胞增殖能力的改变。RT-PCR和Western杂交检测各代细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平的改变;爱茜蓝法检测糖胺聚糖(GAG)的含量。结果 体外培养兔角膜基质细胞随着传代的进程,逐渐显现衰老的形态特征。细胞群体倍增时间由第7代起显著延长(P<0.01);MTT比色法的结果亦显示,第7代细胞的增殖能力开始大幅下降(P<0.01)。第9-11代时,Ⅰ、Ⅲ型胶原在mRNA和蛋白水平的表达都有明显减少(P<0.01),降至第1代细胞的30％左右;GAG的含量也降至40％左右。结论 兔角膜基质细胞经历长期体外培养后,细胞增殖能力和胞外基质表达水平显著下降,逐渐丧失原有的功能。但作为构建组织工程化角膜的种子细胞,在它的生物学特性未发生改变之前,经3次传代培养,获取的细胞量达到组织块消化所得细胞的240倍左右,已足以用于构建之用。     

异体阔筋膜细胞外基质作为肾修补材料的生物相容性研究

目的 研究异体阔筋膜细胞外基质（ECM）的生物相容性,探讨开发一种新的肾损伤修补材料。方法将犬的阔筋膜用脱细胞液及DNA酶、RNA酶等处理,制成异体阔筋膜ECM。制备阔筋膜ECM浸提液,对昆明种小白鼠行急性全身毒性试验;用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法对小鼠成纤维细胞进行细胞毒性检测。将犬左肾制成肾损伤模型,用异体阔筋膜ECM进行修补,分别于术后不同时段于修补局部取材行光镜及扫描电镜检查。结果阔筋膜ECM浸提液注射后4h,小鼠无异常反应,第1～3天体重均呈增长趋势,未发现死亡和中毒反应,与阴性对照生理盐水组无明显差别。MTT法显示细胞相对增殖率（RGR）为112％（第2天）、96％（第4天）及97％（第7天）,毒性评定相应为0、1、1级,材料无明显细胞毒性。术后各时段ECM材料修补局部均无明显的炎性细胞浸润,与周围组织无明显粘连。结论 异体阔筋膜ECM具有良好的生物相容性,有望成为理想的肾损伤修复材料。     

琼脂糖覆盖法构建体外三维培养角膜基质细胞模型的研究

目的:建立琼脂糖覆盖法结合Transwell培养皿体外三维培养牛角膜基质细胞模型,评价其是否具有与角膜基质类似结构特点,为体外研究角膜基质创伤修复或角膜基质组织工程学提供候选模型.方法:应用原代培养的牛角膜基质细胞,种植于Transwell培养皿上室,实验组覆盖以琼脂糖,对照组无琼脂糖覆盖.培养2 d和2周时分别应用激光共聚焦显微镜扫描培养物,计算各培养皿细胞层数,比较实验组和对照组细胞层数.结果:培养2 d,实验组与对照组细胞层数分别为(0.92±0.13)层及(0.89±0.13)层;培养2周后,实验组与对照组细胞层数分别为(1.75±0.22)层及(1.42±0.28)层,实验组与对照组细胞层数均显著增加(P＜0.01),而实验组细胞层数明显多于对照组(P＜0.01).培养2周,实验组可以形成近2层平行的细胞.结论:琼脂糖覆盖法结合Transwell培养皿培养牛角膜基质细胞可以形成2层平行细胞培养物,该模型可作为角膜基质细胞体外三维培养的候选模型.     

兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性

目的改进兔角膜基质细胞培养技术,观察其生物学特性。方法　先同时消化角膜上皮及内皮层,然后刮去上皮、内皮、前弹力和后弹力层,接着将剩余的基质层剪碎消化、接种,采用MTT法观察细胞生长情况,并对比有、无血清培养基对细胞生长的影响。结果　角膜基质细胞10d后形成细胞单层,增殖旺盛。有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰,无血清培养基培养的细胞生长较慢,第9天左右达到生长高峰。结论　改进的角膜细胞培养技术简便、成功率高,培养出的角膜基质细胞生长良好。血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

嗅鞘细胞和骨髓基质细胞的联合培养研究

目的探讨体外联合培养嗅鞘细胞(OECs)和骨髓基质细胞(BMSCs)的可行性及形态学观察。方法将原代培养的OECs和BMSCs消化制成细胞悬液,以相同比例接种,接种密度为104/ml。10 d后将联合培养的细胞置于倒置相差显微镜下进行形态学观察,并于鉴定前2 d加入细胞掺入剂BrdU,应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定。结果联合培养的细胞在24 h内均完全贴壁,培养5 d后镜下可见细胞形态主要有3种:①双极、三极或多极形;②短梭形,突起较短;③扁圆形或不规则形。到第10天时部分细胞相互编织成网,部分细胞生长呈条索状,相互平行。荧光鉴定显示:荧光双标阳性者(既发红色荧光又发绿色荧光)为OECs,只发红色荧光而不发绿色荧光者为BMSCs。结论OECs与BMSCs在体外可以很好的联合培养,生物学特性均保持不变,为体内联合移植奠定了基础。     

囊性肾细胞癌的诊治

目的：提高囊性肾细胞癌的诊断和治疗水平。方法：回顾分析了自1986年1月至1996年7月间13例囊性肾细胞癌和同期244例实质性肾细胞癌的临床资料。结果：囊性肾细胞癌术前影像学检查的正确率为76.9%，手术治疗的5年生存率达92.3%。核分级和TNM分期较低，肿瘤细胞类型为透明细胞。结论：囊性肾细胞癌是一种恶性度较低的肿瘤，应与肾细胞癌囊性坏死等肾囊性病变鉴别。     

人子宫内膜间质细胞的体外培养

目的：建立分离培养符合实验要求的人在位及异位子宫内膜间质细胞的方法,为进一步探讨子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：胶原酶消化在位和异位内膜组织,进行原代培养,胰蛋白酶消化法传代培养,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果：角蛋白、波形蛋白染色证实细胞纯度达95%以上。 结论：胶原酶消化法简便易行,可获得符合实验要求的人子宫内膜间质细胞,可以用于子宫内膜异位症发病机制、药物筛选等研究。     

子宫内膜基质干细胞培养方法的比较研究

目的通过贴壁纯化技术和磁珠分选法培养人子宫内膜基质干细胞,并对两种方法进行比较,寻求既能方便获得大量子宫内膜基质干细胞,又能减少其分化的理想分离培养方法。方法采用贴壁纯化和磁珠分选法分离培养子宫内膜基质细胞,通过倒置显微镜观察细胞的形态,免疫组化鉴定细胞的来源,流式检测CD146和CD90的表达鉴定基质干细胞。通过比较细胞的克隆形成率和CD146、CD90阳性率的差异,综合评估2种培养方法的优劣。结果倒置显微镜观察2种培养方法所得子宫内膜基质细胞均多呈梭形;波形蛋白免疫组化染色均呈阳性。流式细胞仪检测贴壁纯化培养的基质细胞中CD146、CD90阳性率为51.45%、47.24%;磁珠分选法培养体系为CD146、CD90阳性率为63.53%、77.48%。贴壁纯化和磁珠分选法培养的子宫内膜基质细胞克隆形成率分别为(1.25±0.18)%和(3.3±0.4)%。结论贴壁纯化和磁珠分选培养作为子宫内膜基质干细胞的2种培养方法,均可以获得未分化的干细胞。用磁珠分选培养干细胞的方法比较复杂,但可获得大量的干细胞。用贴壁纯化技术培养干细胞方法简单,但细胞不易贴壁,且数量较少,但也能有效分离出较纯的干细胞,保持较好的细胞活性。     

飞秒激光辅助的兔眼角膜基质透镜移植观察

目的 评估飞秒激光辅助的基质透镜移植术的安全性、屈光度的变化及组织的修复。方法 6只新西兰大白兔,麻醉后左眼行飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(SMILE),右眼行飞秒激光辅助的自体角膜基质透镜术。术后1天、1周、1月、2月、3月行眼表反应、前节OCT、屈光状态、Pentacam角膜地形图及角膜共焦激光显微镜观察,术后3月观察完毕后处死兔子,行眼球摘除术,分离兔角膜,经苏木精-伊红染色,行光学显微镜观察。结果 术后观察透镜保持透明,未见排斥反应。中央角膜厚度在透镜植入术前为(357.17±12.97)μm,术后1周、1月、3月分别为(433.67±12.19)μm、(423.50±13.49)μm、(417.33±12.08)μm;等效球镜术前为(0.57±1.13)D,术后1周、1月、3月的等效球镜分别为(-1.98±1.18)D、(-2.65±0.47)D、(-1.84±0.68)D;前表面Km术前为(47.80±1.02)D,术后1周、1月、3月分别(53.85±0.99)D、(52.67±1.32)D、(52.53±0.96)D;后表面Km术前为(-6.18±0.15)D,术后1周、1月、3月分别为(-5.78±0.19)D、(-5.73±0.20)D、(-5.50±0.14)D。整体比较术前术后的中央角膜厚度、等效球镜、前表面Km和后表面Km,差异均具有统计学意义(P＜0.001),各个指标术后1周、1月、3月分别与术前相比差异均具有统计学意义(均为P＜0.05),而各个指标在术后不同时间点两两相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。术后3个月随访前节OCT检查均可观察到透镜界面,但透镜界线随时间延长逐渐模糊;角膜共焦激光显微镜检查术后早期透镜界面可见高反光颗粒,1月可见神经纤维长入透镜,术后2月角膜细胞形态接近正常,术后3个月角膜细胞形态、数量基本正常,神经纤维可见细小分支;HE染色见角膜结构完整,移植的透镜在位,可观察到透镜的前后界面,纤维排列整齐,平行分布,结构清晰。结论 自体角膜基质透镜植入有较好的安全性、有效性及稳定性。透镜植入术后角膜重塑及屈光度的变化尚需要更长时间和更多样本的观察研究。     

前癃通含药血浆对前列腺间质细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨前癃通胶囊含药血浆对体外培养前列腺间质细胞增殖和凋亡的影响,为中药复方治疗前列腺增生（BPH）提供实验理论依据.方法 按随机原则对入选患者进行实验分组,制备低、中、高剂量前癃通含药血浆,当细胞接近长成单层后进行免疫荧光检测间质细胞鉴定,加含药血浆后培养0、24、48、72 h 再分别进行[3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT 法3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]检测,培养到24 h 进行流式细胞分析法检测（Flow Cytometry,FCM）.结果 MTT 法检测,不同剂量含药血浆作用于前列腺间质细胞以后,24 h时高剂量组与各组比较差异均有显著统计学意义（P〈0.01）;48 h 时各剂量组间比较差异均有显著统计学意义（P〈0.01）;72 h 时高、中剂量组与空白组比较差异均有显著统计学意义（P〈0.01）,高剂量组与各组比较差异均有显著统计学意义（P〈0.01）.流式细胞检测,中剂量组与空白组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）;高剂量组与各组间比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）.结论 中药前癃通含药血浆可抑制体外培养前列腺间质细胞增殖,促进前列腺间质细胞凋亡.     

胶原-壳聚糖和角膜基质细胞复合膜的构建及其生物相容性

目的：探讨以胶原-壳聚糖为生物支架构建角膜基质细胞复合膜及其生物相容性。方法：兔和人角膜基质细胞分离培养后种植到胶原-壳聚糖共混膜上,构建成复合膜后移植到异体大耳白兔角膜基质囊袋中,术后1、2和4周时分别于活体进行前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化检测,观察复合膜中角膜基质细胞生长状态、生物支架对正常角膜细胞的影响及生物膜的降解情况。结果：活体前节OCT、Cs-4检查和离体组织学及免疫组化观察结果显示,兔和人角膜基质细胞在胶原-壳聚糖共混膜上生长良好,移植后复合膜逐渐发生降解,角膜组织未发生坏死和溶解,角膜上皮、基质和内皮细胞形态结构正常。结论：胶原-壳聚糖可作为角膜基质构建的生物支架,角膜共焦显微镜及前节OCT作为新的手段可活体观察构建后的角膜基质生物学活性。     

旋转培养仪在细胞培养中的应用

目的:探讨旋转细胞培养仪(rotary cell culture system,RCCS)在组织工程学中的应用及组织工程学研究中种子细胞的扩增方法问题.方法:将多孔羟基磷灰石(porous hydroxyapatite,PHA)与骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)在旋转培养仪中进行旋转复合培养,电镜(scan electric microcopy,SEM)观察细胞在PHA上的生长和增殖情况,与培养板培养法对比.并行AKP染色.结果:普通培养板中细胞主要黏附在PHA与培养板相接触的一侧,在载体的内部难以见到细胞分布.试验组中细胞均匀分布于材料的各个部位,细胞突起相连,交织呈网状.试验组中细胞数量多于对照组.AKP染色与旋转培养前无变化.结论:应用旋转细胞培养仪进行三维立体培养有利于细胞在支架上生长,提高细胞数量,改善细胞状况.对细胞分化无影响.     

兔角膜内皮细胞的新法培养

目的：介绍一种全新的角膜内皮细胞培养方法。方法：在体视显微镜下撕下角膜后弹力层及内皮细胞层并剪切成小块,分置于培养皿中,将盖玻片叠加在组织块上进行培养。结果：角膜内皮细胞很快自组织块迁移生长,结论：本法培养内皮细胞不需用酶,具有简便,可靠,不易污染,细胞量大的优势,值得推广。     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．