糖基化终末产物对体外培养牛眼小梁细胞氧化应激及凋亡的影响

目的通过观察糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGE)对体外培养牛眼小梁细胞凋亡的影响,研究AGE与原发性开角型青光眼(primaryopenangleglaucoma,POAG)之间的关系,进一步探讨其发病机制。方法 体外培养牛眼小梁细胞,通过形态学观察和神经元特异性烯醇化酶染色对培养的细胞进行鉴定。将第3代小梁细胞接种于6孔培养板,在培养基中加入不同浓度(0μgmL-1、50μgmL-1、100μgmL-1、200μgmL-1)的AGEBSA培养96h。终浓度(200μgmL-1)的AGEBSA培养液处理细胞不同时间(48h、72h、96h)。应用流式细胞仪检测小梁细胞凋亡率;活性氧荧光探针2’,7’二氯荧光黄双乙酸盐检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果 50μgmL-1、100μgmL-1、200μgmL-1AGEBSA作用96h后细胞凋亡率分别为(5.60±0.25)%、(9.57±0.08)%、(17.68±0.21)%,与对照组(0μgmL-1AGEBSA)细胞凋亡率(445±0.12)%相比均明显增高,且差异均有统计学意义(均为P<0.05);200μgmL-1AGEBSA作用细胞48h、72h、96h后凋亡率分别为(10.51±0.28)%、(13.47±0.42)%、(17.68±0.21)%,与对照组相比也均明显增高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与对照组比较,AGEBSA处理后细胞内ROS水平显著提高,差异有统计学意义(P<0.05),BSA组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在体外培养的条件下,AGE可能通过刺激牛眼小梁细胞产生大量ROS介导小梁细胞凋亡。     

丹参干预成纤维细胞增生及其机制

目的观察丹参对结膜成纤维细胞增生的抑制作用并探讨其作用机制,为临床防治PVR提供新的治疗方法。方法以体外培养的兔结膜成纤维细胞为研究对象,以地塞米松、5-氟尿嘧啶、氢化可的松作为处理对照组,用MTT法测定不同浓度丹参作用48h后成纤维细胞增生情况。AnnexinV-FITC和碘化丙啶双染法,在流式细胞仪下测定不同浓度丹参作用不同时间后成纤维细胞的早期凋亡率。用末端脱氧核糖核酸酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL法)观察丹参作用48h后的细胞凋亡情况。结果丹参在一定浓度范围内(1.74～111.00g·L-1)可抑制成纤维细胞增生,且呈剂量依赖关系(0.91%～79.28%)。3.47g·L-1、27.75g·L-1及111.00g·L-1丹参作用6h时细胞凋亡率分别为(8.67±0.97)%、(11.04±1·04)%、(20.83±1.74)%,作用24h时分别为(13.06±1.41)%、(25.68±1.21)%、(39.65±0.23)%,细胞早期凋亡率与正常对照组(4.40±0·08)%相比差异均有统计学意义(均为P<0.01)。丹参作用48h后,成纤维细胞核出现阳性着色。结论丹参可以通过诱导成纤维细胞凋亡的方式来抑制成纤维细胞的增生,有望成为新的防治PVR药物。     

蓝光诱导氧化应激反应参与视网膜色素上皮细胞凋亡机制研究

目的 研究氧化应激反应参与蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,hRPE)凋亡的作用机制及其与时间的关系.方法 用LED蓝光光源建立蓝光损伤体外培养的hRPE细胞模型,蓝光辐射强度为(4.0±0.5) mW·cm-2,并将细胞分为光照时间0h(正常对照组)、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、12 h组.透射电镜观察细胞的超微结构,流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内活性氧水平,WesternBlot技术检测Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达情况.结果 各光照组细胞均有不同程度的胞浆减少、空泡状改变、线粒体肿胀、微绒毛减少或脱落.正常对照组、光照1h、2h、3h、4h、5h、6h、12 h的细胞凋亡率分别为(5.30±0.64)％、(5.90±0.89)％、(6.80±0.98)％、(7.70±0.76)％、(9.60±1.10)％、(11.45 ±2.60)％、(14.90±1.60)％及(23.90±1.20)％,与正常对照组比较,光照4h后细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).正常对照组、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h组hRPE细胞生成的ROS相对量分别为(12.90±1.18)％、(20.09±0.63)％、(23.91±1.47)％、(29.14±1.94)％、(34.30±1.84)％、(38.97±1.68)％、(44.08±0.83)％、(57.76±2.80)％,光照0.5h后细胞产生的ROS明显升高,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).Caspase-3及Bax在3h后轻微上调,而5～6h后表达上调较明显,Bcl-2的表达则在3h后下调明显,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 蓝光可通过产生的氧化应激反应激活细胞凋亡系统导致细胞损伤,光照持续3h时细胞可能出现了损伤但不明显,光照5～6h后出现了较为明显的细胞凋亡.     

TGF-β1基因转染可抑制人晶状体上皮细胞增殖

目的:探讨脂质体介导的TGF-β1基因(pEGFP-TGF-β1)转染对人品状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEC-B3)增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法:将pEGFP-TGF-β1转染HLEC-B3,观察细胞形态变化;采用乍长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA 倍体法).结果:pEGFP-TGF-β1成功转染后,HLEC-B3逐渐变圆、脱壁.转染后24～48h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);凋亡细胞比例(转染24h为(21.0±1.7)%,转染48h至(43.6±1.4)%明显升高,与相应对照组[24h为(0.42±0.06)%,48h为(0.60±0.02%)]比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染 24h 为(72.0±1.9)%,转染48h为(74.7±2.2)%]增加和S期细胞比例[转染24h为620.4±2.2)%,转染48h为(19.4±1.4)%]下降,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:pEGFP-TGF-β1可成功转染HLEC-B3,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤细胞生长的影响

目的 研究溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞生长的影响.方法 MTT法测定不同浓度(5μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40μmol·L-1和80 μmol·L-1)和不同时间(分别作用24 h和48 h)溪黄草乙素对人Rb细胞株增殖的影响;碘化丙啶染色,流式细胞术观察溪黄草乙素对Rb细胞周期及细胞凋亡的影响.结果 溪黄草乙素各个剂量组对Rb细胞的增殖均有显著抑制作用,OD值随溪黄草乙素浓度升高而下降,抑制率随浓度增加而增加.溪黄草乙素对Rb细胞株的IC50为130 μmol·L-1,且随着溪黄草乙素剂量增加对Rb细胞株抑制作用增强.不同剂量组(对照组、5 μmol·L-1组、10 μmol·L-1组、20 μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80 μmol·L-1组)溪黄草乙素作用Rb细胞24 h后,细胞凋亡率分别为:(1.07±0.03)%、(5.13±0.82)%、(8.67±1.20)%、(14.39±2.07)%、(26.45±3.01)%、(34.18±1.25)%;作用Rb细胞48 h后,细胞凋亡率分别为:(2.36±0.27)%、(6.49±1.15)%、(11.90±1.54)%、(19.21±2.66)%、(37.10±3.62)%、(47.55±3.19)%.表明溪黄草乙素作用Rb细胞24 h和48 h后Rb细胞的凋亡率在各个剂量组均显著升高,也呈现一定的剂量-效应关系,提示溪黄草乙素对Rb细胞凋亡率的影响随着剂量增加而升高.结论 溪黄草乙素可阻滞细胞进入C2/M期,进而诱导Rb细胞株凋亡.     

大鼠眼钝挫伤后晶状体上皮细胞的凋亡及Survivin基因对凋亡的影响

目的 检测大鼠眼钝挫伤后晶状体上皮细胞凋亡的特点,探讨Survivin基因对晶状体上皮细胞凋亡的影响.方法 45只成年Wistar大鼠随机选取5只作正常对照组,其余40只随机分为A组、B组、C组、D组4组,每组各10只.除正常对照组外,其余鼠均用20 g钢球打击一眼制造眼钝挫伤模型后,于1h(A组)、12 h(B组)、24h(C组)、48 h(D组)后摘出晶状体,检测晶状体上皮细胞的凋亡及Survivin基因的表达情况.结果 正常对照组及A组大鼠未检测到晶状体上皮细胞的凋亡及Survivin的表达.B组、C组、D组大鼠可见晶状体上皮细胞的凋亡,凋亡率分别为(14.54±2.98)％、(41.54±6.07)％及(25.38±4.72)％,C组细胞凋亡率最高,与B组和D组相比差异均有统计学意义(=9.19、6.64,均为P＜0.05).B组、C组、D组中均可见Survivin基因的表达,相对表达量分别为0.357±0.105、0.582±0.131及0.386±0.143.B组、C组、D组中Survivin基因的表达量均与凋亡率呈显著负相关(r分别为-0.795、-0.806、-0.832,均为P＜0.05).结论 大鼠眼钝挫伤后可见晶状体上皮细胞凋亡及Survivin基因的表达,凋亡高峰出现于钝挫伤后24h,Survivin基因可能对钝挫伤引起的晶状体上皮细胞凋亡有抑制作用.     

枸杞多糖对H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的 探讨枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)对H2O2诱导人晶状体上皮细胞(SRA01/04)氧化应激损伤的保护作用.方法 将SRA01/04细胞传代培养24h后,加入不同浓度(50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1600 mg·L-1)LBP预处理24 h,之后加入200 μmol·L-1H2O2继续培养24 h,用CCK-8检测LBP对H2O2诱导的SRA01/04细胞活力的影响并筛选出LBP最佳保护浓度用于后续实验.采用流式细胞仪检测SRA01/04细胞凋亡率和线粒体膜电位变化情况,Western blot检测各组凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达情况.结果 CCK-8检测结果显示:LBP浓度为200 mg·L-1和400 mg·L-1时,能够促进SRA01/04细胞增殖,细胞存活率分别为(121.10±5.56)％和(128.20 ±3.79)％,与对照组(99.98±4.73)％比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2模型组SRA01/04细胞经氧化应激损伤后,细胞存活率(51.67±4.91)％明显降低,与对照组(99.67±2.52)％相比,差异有统计学意义(P ＜0.001).用200 mg·L-1和400mg·L-1 LBP预处理后,SRA01/04细胞存活率明显提高至(74.01±3.21)％及(84.67±4.33)％,与H2O2模型组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01).400 mg·L-1 LBP对RA01/04细胞氧化应激损伤保护作用最大.流式细胞仪检测结果显示:对照组细胞凋亡率为(5.1±1.2)％;H2O2模型组细胞凋亡率为(25.9±1.5)％;400 mg·L-1 LBP预处理后,细胞凋亡率降至(13.8±1.2)％,与H2O2模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).线粒体膜电位检测结果显示:对照组阳性细胞数最多,线粒体膜电位高;H2O2模型组阳性细胞数最少,线粒体膜电位低;400 mg·L-1 LBP预处理后,阳性细胞数增多及线粒体膜电位升高,与H2O2模型组相比,差异有统计学意义(P＜0.001).Western blot检测显示:与对照组相比,H2O2模型组Bcl-2表达下降,Bax表达上升(P＜0.01);经400 mg·L-1 LBP预处理后,Bcl-2表达上升,Bax表达下降,与H2O2模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 LBP对H2O2诱导人晶状体上皮细胞的氧化应激损伤具有保护作用,可抑制细胞凋亡.     

蓝萼香茶菜乙素对Rb细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨蓝萼香茶菜乙素对体外培养的人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的增殖及细胞周期的影响。方法 MTT法测定不同浓度(2.5μmol.L-1、5.0μmol.L-1、10.0μmol.L-1、20.0μmol.L-1和40.0μmol.L-1)的蓝萼香茶菜乙素作用24h及48h后对人Rb细胞株的影响;碘化丙啶染色、流式细胞术观察蓝萼香茶菜乙素对Rb细胞周期及细胞凋亡的影响。结果蓝萼香茶菜乙素不同剂量组对Rb细胞均有显著细胞毒作用。蓝萼香茶菜乙素处理24h和48h后对Rb细胞株的IC50分别为79.15μmol.L-1和10.88μmol.L-1,剂量-效应关系较为明显;对照组和不同药物浓度组(2.5μmol.L-1组、5.0μmol.L-1组、10.0μmol.L-1组、20.0μmol.L-1组、40.0μmol.L-1组)作用Rb细胞24h后,细胞凋亡率分别为:(2.01±0.03)%、(6.21±0.91)%、(10.21±2.06)%、(16.83±2.61)%、(25.17±2.11)%和(35.29±1.04)%;作用48h后,对应细胞凋亡率分别为:(2.41±0.73)%、(7.94±3.01)%、(12.08±2.43)%、(20.11±2.37)%、(35.18±3.48)%和(51.20±2.93)%。这一结果也显示:随着药物浓度增加,Rb细胞凋亡率也随之升高。结论蓝萼香茶菜乙素通过诱导Rb细胞株凋亡发挥抑制人Rb增殖的作用。     

可见光对体外培养兔视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

目的研究可见光对体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigmen tepithelium,RPE)细胞凋亡的影响。方法用两步酶法消化分离、培养并鉴定RPE细胞。RPE细胞分为对照组及实验组,实验组用(3652±213)Lux的白色荧光灯照射6h。分别于光照前及光照后3h、12h、24h、72h终止培养,取细胞行Bcl-2mRNA原位杂交检测,观察细胞Bcl-2基因表达情况。选取部分光照后24h组细胞进行透射电镜的观察。结果对照组各时间点Bcl-2mRNA原位杂交阳性细胞率无统计学差异(P>0.05)。实验组光照后3h阳性细胞率为(82.29±5.65)%,有轻度增高,但无统计学意义(P>0.05);光照后72h阳性细胞率为(44.07±7.11)%,光照后12h、24h、72h阳性细胞逐渐减少,均有统计学意义(P<0.05)。RPE细胞光照后透射电镜观察到染色质碎裂、凋亡小体等细胞凋亡的典型形态学变化。结论一定强度的可见光照射可引起体外RPE的凋亡。光照后一定时间内可以刺激并启动细胞自身的保护机制。     

CXCR3、IP10对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的研究CXCR3及IP10对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)凋亡的影响,并对其机制进行初步探讨。方法 HUVEC在高糖和正常糖DMEM培养液中分别培养24h、48h、72h,流式细胞术检测凋亡率,Westernblot检测CXCR3表达。反义肽核酸(asPNA)阻断高糖组细胞表达CXCR3后,Westernblot检测CXCR3表达,流式细胞术检测凋亡率。CXCR3配体IP10及拮抗剂AMG487干预高糖组细胞48h后,流式细胞术检测凋亡率。结果 高糖组48h、72h时细胞凋亡率(22.56±1.83)%、(25.33±2.34)%较对照组(3.01±0.27)%、(3.80±0.32)%增加显著(均为P<001)。高糖组48h、72hCXCR3表达量0.57±0.04、0.87±0.03较对照组48h0.36±0.02、0.71±0.02明显上调(P<0.01、<005)。1μmolL-1asPNACXCR3组、2μmolL-1asPNACXCR3组CXCR3表达量0.32±0.02、0.14±0.02均较空白对照组(0.61±0.02)及阴性对照组(0.59±0.03)显著下降(均为P<0.01)。同时,1μmolL-1asPNACXCR3组、2μmolL-1asPNACXCR3组细胞凋亡率(15.33±1.05)%、(9.00±0.76)%也较空白对照组(22.98±1.92)%及阴性对照组(21.34±1.73)%明眼科新进展 2014年7月 第34卷 第7期显下降(均为P<001)。IP10组细胞凋亡率(38.05±2.88)%较高糖对照组(21.11±2.02)%、IP10+AMG487组(20.80±217)%及AMG487组(19.54±1.93)%显著增加(均为P<0.01)。结论 CXCR3、IP10促进高糖诱导的HUVEC凋亡,其促凋亡机制与IP10/CXCR3轴有关。