重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

日本血吸虫（中国大陆株）FABPc重组抗原高效融合表达,纯化及 …

目的 构建Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ表达克隆,获得大量纯化ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ重组（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以ＰＣＲ法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１进行融合表达,经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱和ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ＾ＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ酶切后纯化出ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ,Ｗｅｓｔｅｒｎ     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjFABPc)基因DNA重组质粒pCD-SjFABPc在哺乳动物细胞中的表达

目的　观察裸DNA重组质粒pCD -SjFABPc在体外转染HepG2细胞以及质粒DNA免疫鼠肌组织中的表达 ,为进一步应用该质粒进行DNA免疫实验奠定基础。方法　用脂质体介导DNA转染法将pCD -SjFABPc转染贴壁细胞HepG2 ,G418加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养 ,SDS -PAGE及Western -blot鉴定目的基因在HepG2细胞中的表达 ;将pCD -SjFABPc质粒肌注免疫BALB/c小鼠 ,于 6 5d后取注射部位的肌组织约 0 3cm3 大小 ,经固定、包埋、切片 ,免疫酶组织化学染色 ,显微照相记录。结果　在被转染的HepG2细胞裂解样品中 ,呈现一分子量约 14kDa大小且能被感染兔血清特异识别的条带 ;免疫组化结果显示免疫组切片标本中有特异性阳性反应。结论　pCD -SjFABPc质粒能在HepG2细胞及小鼠肌细胞中表达目的蛋白     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.     

日本血吸虫(中国大陆株)FABPc重组抗原高效融合表达、纯化及免疫学活性鉴定

目的　构建Sj-FABPc表达克隆 ,获得大量纯化rSj-FABPc重组 (日本血吸虫脂肪酸结合蛋白 )抗原 ,了解其作为候选疫苗抗原的潜能。方法　以PCR法从Sj-cDNA库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体pGEX - 6P - 1进行融合表达 ,经GlutathioneSepharoseTM4B亲和层析柱和PreScissionTMProtease酶切后纯化出rSj-FABPc ,Westernblot鉴定其抗原性 ,以rSj-FABPc免疫小鼠 ,制备特异性抗血清 ,并用ELISA法检测重组抗原的免疫活性。结果　纯化的rSj-FABPc能被血吸虫成虫免疫兔血清和急、慢性血吸虫病人血清所识别 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,抗体滴度为 1∶12 80 0。结论　rSj-FABPc具有良好的抗原性 ,能有效地诱导小鼠产生特异性抗体     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因在大肠杆菌的表达

目的　克隆并表达日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因以制备血吸虫疫苗候选分子。方法　利用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增日本血吸虫大陆株的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 基因, 经 Ｂａｍ Ｈ Ｉ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ双酶切后定向克隆于原核表达质粒 Ｐ Ｅ Ｇ Ｘ２ － Ｔ, 并在大肠杆菌进行表达研究。结果　获得目的基因克隆, 在大肠杆菌可诱导表达约４４ｋ Ｄ 的融合蛋白, 该重组抗原能被慢性血吸虫病人血清特异性识别。结论　成功地表达了一种血吸虫疫苗候选抗原, 为进一步研究打下基础。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白重组抗原对小鼠免疫保护性的研究

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )脂肪酸结合蛋白 (Sj FABPc)重组抗原作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能 ,并探讨Sj FABPc/Sj2 6GST融合蛋白作为复合疫苗的可能性。 方法　用亲和层析法制备Sj FABPc重组抗原和Sj FABPc/Sj2 6GST融合蛋白。将两种蛋白分别免疫BALB/c小鼠后进行攻击感染试验。结果　Sj FABPc及Sj FABPc/Sj2 6GST分别诱导小鼠产生了 2 3 6 0 % (P <0 0 5 )和 2 1 72 % (P >0 0 5 )的成虫减虫率 ,5 9 36 % (P <0 0 0 1)和 4 9 6 8% (P <0 0 0 1)的总减卵率。结论　rSj-FABPc具有一定的疫苗应用价值     

日本血吸虫22.6 kDa重组抗原的高效融合表达及特性鉴定

目的： 大量获得纯化的日本血吸虫２２６ ｋ Ｄａ 重组抗原。方法： 用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法将其编码基因序列经改造后亚克隆入载体质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ １λ Ｔ 进行表达。结果： 得到了融合表达的蛋白抗原。此融合蛋白表达量大, 用凝血酶酶切后易大量制备纯化的重组２２６ ｋ Ｄａ 抗原。结论： 以此融合蛋白免疫的小鼠抗血清进行免疫印迹试验, 表明 Ｓｊ２２６／ Ｓｊ２６ Ｇ Ｓ Ｔ 融合重组蛋白具有与 Ｓｊ２２６ 蛋白一样的免疫学活性。     

日本血吸虫SjFABPc重组质粒裸DNA免疫小鼠的研究

目的：裸DNA重组质粒pCD-SjFABPc经肌肉注射、皮内途径免疫小鼠,观察其在小鼠体内所诱生的细胞及体液免疫应答。方法：碱裂解法大量制备重组质粒pCD-SjF加强免疫1次。分别于末次免疫后的第20、50、65天共3次用MTT法检测脾脏T淋巴细胞增殖与NK细胞活性,并用双夹心ELISA测定血清细胞因子IL－2、IFN－γ及IL－10含量;ELISA法测定免疫鼠血清IgG抗体。结果：MTT法3次动态测定NK细胞及脾淋巴细胞增殖,不同途径pCD-SjFABPc质粒免疫组均明显高于生理盐水（NS)极空质粒对照组（P＜0．05）。不同途径pCD-SjFABPc免疫组IL－2血清含量的平均值均显著高于NS与空质粒对照组（P＜0．01）;IFN－γ的值也均显著高于NS对照组（P＜0．01）,但与空质粒对照组的差异无显著性（P＞0．05）;不同途径pCD-SjFABPc免疫组IL－10值与NS极空质粒对照组的比较则差异无显著性（P＞0．05）。重组质粒免疫后20d、50d检测,抗体滴度无明显增高;65d检测,pCD-SjFABPc免疫组A值明显高于对照组（P＜0．01）。结论：重组质粒免疫后可诱导小鼠产生有效的细胞与体液免疫应答,且能诱导产生同样类型的细胞因子。     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）基因DNA重组质粒 …

目的 观察裸ＤＮＡ重组质粒ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ在体外转染ＨｅｐＧ２细胞以及质粒ＤＮＡ免疫鼠肌组织中的表达,为进一步应用该质粒进行ＤＮＡ免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导ＤＮＡ转染法将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ转染贴壁细胞ＨｅｐＧ２,Ｇ４１８加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定目的基因在ＨｅｐＧ２细胞中的表达,将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ质粒肌注免疫ＢＡＬＢ     

日本血吸虫中国大陆株重组脂肪酸结合蛋白(sj-FABPc)的特性和抗原表位的分析

目的 了解重组的日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白（ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ）的特性及预测其抗原表位。方法 以ＰＣＲ方法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段,并亚克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,对其核苷酸序列进行测定。以ＧＯＬＤＫＥＹ软件和Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ数据库分析Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ的核苷酸序列和其编码的蛋白质特性,预测重组抗原的表位。结果 核酸序列分析证明,克隆基因确为Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ,并由     

日本血吸虫未知基因的原核表达载体的构建和表达分析

目的构建日本血吸虫未知基因的原核表达载体,研究基因性质. 方法首先将从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选得到的未知基因cDNA JAYL0230亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导重组蛋白的表达,免疫印记实验检测其免疫性质. 结果成功构建重组原核表达载体pET28a(+)-JAYL0230,并获得稳定表达的融合蛋白,免疫印记实验证明该融合蛋白具有免疫反应性. 结论本实验为进一步深入研究该基因的性质及功能提供了基础.     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa基因克隆与表达的研究

目的 :分离 Sj22.6抗原基因 ,构建 Sj22.6表达克隆。方法 :抗体筛选 Sj成虫 cDNA库 ,PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入表达载体 pGEX- 1λt。对重组体进行诱导表达并对表达产物进行 SDS- PAGE和 Western blot分析。结果 :PCR扩增产物为约 930 bp的 DNA条带。亚克隆入pGEX- 1λt,获得两个表达克隆 pGSj6和 pGSj24 ,特异性表达产物为 22.6k Da抗原。重组体的表达方式为分离表达。结论 :从日本血吸虫成虫 cDNA库筛选到 Sj22 .6k Da克隆化基因 ,并构建了表达克隆 pGSj2 4和 pGSj6。     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj22.6kDa基因克隆与表达的研究

目的 :分离 Sj2 2 .6抗原基因 ,构建 Sj2 2 .6表达克隆。方法 :抗体筛选 Sj成虫 c DNA库 ,PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入表达载体 p GEX- 1λt。对重组体进行诱导表达并对表达产物进行 SDS- PAGE和 Western blot分析。结果 :PCR扩增产物为约 930 bp的 DNA条带。亚克隆入p GEX- 1λt,获得两个表达克隆 p GSj6和 p GSj2 4 ,特异性表达产物为 2 2 .6k Da抗原。重组体的表达方式为分离表达。结论 :从日本血吸虫成虫 c DNA库筛选到 Sj2 2 .6k Da克隆化基因 ,并构建了表达克隆 p GSj2 4和 p GSj6。     

日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶特异性肽段的基因克隆表达及特性鉴定

目的：应用基因工程方法制备SjC-TPI中特有抗原表位区域的肽段,方法：用PCR法对SjC-TPI与人的TPI相应部位同源性较低的两个亲水区15－66aa和129－163aa的DNA的基因列进行扩增,采用基因拼接法连接后,克隆入表达质粒载体pMAL－c2x,转化入大肠杆菌TB1,进行表达和鉴定。结果：该目的基因片段被成功地克隆入表达质粒载体pMAL-c2x并能融合表达,经进一步纯化获得特异的重组肽段具有良好的抗原性,能被日本血吸虫病人血清识别,而不被正常人血清识别,结论：获得与人的TPI同源性较低的特异重组肽段,为日本血吸虫复合多肽抗疫苗的制备提供了物质基础。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因在家蚕细胞及幼虫中的表达

目的： 在家蚕细胞和幼虫中表达日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（ Ｓｊ１４） 基因。方法： 将该基因克隆于昆虫病毒转移载体ｐ Ｂａｃ Ｐ Ａ Ｋ Ｈｉｓ１ 中, 再与修饰的家蚕核型多角体病毒（ Ｂｍ Ｎ Ｐ Ｖ） 线性化 Ｄ Ｎ Ａ 共转染家蚕细胞,经体内重组得重组病毒 Ｂｍ Ｓｊ１４ , 再将 Ｂｍ Ｓｊ１４ 感染家蚕细胞和幼虫以表达 Ｓｊ１４ , 用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 和间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ测定表达产物的抗原性。结果： Ｂｍ Ｓｊ１４ 感染家蚕细胞和幼虫后 Ｓｊ１４ 获得较高表达; 表达产物ｒ Ｓｊ１４ （ Ｈｉｓ） 为１８ｋ Ｄａ 的融合蛋白, 在家蚕细胞中的产量约为１００ μｇ／１ ×１０６ 细胞, 在培养上清中产量为３３ μｇ／ｍｌ; 在家蚕血淋巴中得量为４ ｍｇ／ｍｌ; 在家蚕幼虫组织的得量为４６ ｍｇ／ｇ 组织。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 和间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 显示ｒ Ｓｊ１４ （ Ｈｉｓ） 具有较高抗原性。结论： Ｓｊ１４ 在家蚕细胞和幼虫中获得高效表达且表达产物具有较高抗原性。