16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的: 运用16S rRNA 基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法: 提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA 基因片段并测序。将测序结果用Blastn 在线软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果: 12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。 结论: 16S rRNA 基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用

目的初步建立一种对肺炎克雷伯菌引起血流感染的快速检测方法。方法应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以特异性引物扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定的对照。结果检测142份已知肺炎克雷伯阳性标本,65份非肺炎克雷伯阴性对照,52份双盲样本显示敏感性为100%（146/146）特异性为100%（113/113）,整个实验可在2h内完成。结论较传统的培养鉴定法而言,以16SrRNA作为实时荧光定量靶基因可快速检测肺炎克雷伯菌,具有很好的研究价值与应用前景。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

16S rRNA基因克隆文库用于菌群分析的效能研究和评价

目的建立16S rRNA基因克隆文库进行菌群相对定量的方法,评价其对细菌的检测效率以及对混合菌群中低含量细菌的分析能力。方法取脆弱类杆菌等9种细菌以相同及级差比例制备细菌悬液,分别用或不用变溶菌素处理后,用试剂盒提取核酸,16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序,建立16S rRNA基因克隆文库,将序列与数据库进行比对分析。结果相同比例制备的菌悬液,加或不加变溶菌素提取的核酸,掺入的9种细菌均可检出。级差比例制备的菌悬液,加变溶菌素提取核酸,掺入的9种细菌均可检出;不加变溶菌素提取核酸,数量少难裂解的革兰阳性菌双歧杆菌未能检出。混合菌悬液中各种细菌的比例与文库反映的各种细菌的比例有数量对应关系,但不是线性对应关系。结论16S rRNA基因序列分析是一种较好的细菌菌群分析方法,它可以同时检出多种细菌,并能对混合细菌标本进行菌群相对定量,反映菌群中各种细菌的丰度,但不能准确定量菌群中各种细菌的数量。     

16S rRNA在肉毒梭菌分型鉴定中的应用

目的建立一种快速、可靠的对肉毒梭菌进行分型鉴定的手段。方法以从LCL063、830110、LC175、LCL155、66418、N153、61082、ALASKA、IWANAI共9株梭菌中提取的基因组DNA为模板,利用16SrRNA特异性引物分别进行PCR扩增并进行T-A克隆转化、测序。通过Clustal和Mega软件分析16SrDNA序列,以NJ法和MP法构建进化树,分析其种属特异性。结果 16SrRNA分型结果可判断出LCL063、830110、LCL175为产E型毒素的酪酸梭菌。IWANAI与ALASKA株为E型肉毒梭菌。与传统分型鉴定得到的结果一致。结论 16SrRNA在肉毒梭菌分型鉴定中具有快速、准确的优势,随着核糖体库的不断完善,有望成为细菌分型鉴定的标准依据。     

流感嗜血杆菌16S rRNA和p6基因PCR检测结果比较

目的 比较流感嗜血杆菌(Hi) 16S rRNA和p6基因的PCR检测结果的差异.方法 以Hi的16S rRNA基因及外膜蛋白p6基因作为靶基因,设计特异性引物分别对临床标本分离的43株Hi进行PCR快速检测. 结果 34株16S rRNA基因扩增出538bp大小DNA片段,检出率为79%;43株p6基因均扩增出296bp大小DNA片段,检出率为100%.同时,其他细菌对照株16S rRNA和p6基因扩增均未出现假阳性结果.结论 相比于16S rRNA基因,p6基因对Hi检测和鉴定更具特异性,可用于临床对Hi感染疾病的快速诊断和流行病学研究.     

经会阴前列腺穿刺组织的细菌16S rRNA基因检测

目的 探讨Ⅲ型前列腺炎(CPPS)的细菌学病因及16s rRNA基因检测对抗生素疗效的预测价值.方法 对112例CPPS患者(年龄20～48岁),经会阴前列腺穿刺取得皮下组织及前列腺组织,用聚合酶链反应法(PCR)检测细菌16S rRNA基因.加替沙星片治疗4周后随访,根据治疗前后慢性前列腺炎症状评分(NIH-cPsI)评定疗效.结果 18例病人因皮下组织中检测到细菌信号疑为污染而排除,94例完成研究.16S rRNA基因总阳性率63.8%(60/94),Ⅲ a型信号阳性率为68.3%(28/41),Ⅲb型60.3%(32/53).抗生素治疗后16S rRNA基因阳性组总有效率优于阴性组(55.0%比14.7%,P<0.001),在分组研究中,Ⅲa型和Ⅲb型阳性组有效率均优于阴性组(75%比23.1%,P<0.001;37.5%比9.5%,P<0.05).结论 部分CPPS与细菌感染有关,前列腺组织16SrRNA基因检测对抗生索治疗有指导意义.     

RT-PCR方法扩增麻风菌16S rRNA在麻风疗效考核中的价值

目的采用RT-PCR方法检测麻风患者治疗前、中、后皮损组织中麻风菌16S rRNA,观察组织中麻风菌活性,建立评价短程联合化疗(MDT)疗效的指标。方法收集14例麻风患者治疗前、中、后皮损组织,根据临床型别和MDT疗期分组,建立RT-PCR方法扩增麻风菌16S rRNA特异片段。结果 4例少菌型(PB)患者,完成治疗后3例阴转,1例虽未阴转,但该病例分型不详,不排除多菌型(MB)的可能;4例MB患者经治疗6～8个月,其中3例检出麻风菌16S rRNA;6例MB患者,2例完成24个月治疗后患者阴转,另4例经12个月的治疗后,2例阴转,1例呈弱阳性,1例阳性。结论对同一患者在不同疗期采用RT-PCR检测16S rRNA,显示随治疗时间的延长,麻风菌活菌量也随之下降,该方法可评价MDT疗效,结合患者的细菌密度指数,可为确定疗期提供依据。     

多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性及16S rRNA甲基化酶基因检测的意义

目的探讨多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性及16SrRNA甲基化酶基因检测的临床意义,为临床合理使用抗生素和控制院内感染提供依据。方法收集2011年3月至2013年12月在南昌市第二人民医院住院的ICU患者各种临床标本分离的多重耐药鲍曼不动杆菌52株。采用纸片扩散(K-B)法对52株多重耐药鲍曼不动杆菌行抗生素药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)检测16SrRNA甲基化酶基因(armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和npmA基因)表达情况。结果 52株多重耐药鲍曼不动杆菌对米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南和亚胺培南耐药率分别为44.2%、53.8%、75.0%和78.8%,对其余14种抗生素耐药率均在90.0%以上。52株多重耐药鲍曼不动杆菌中有38株检出armA基因表达,表达率为73.1%(38/52);其余均未检出。结论多重耐药鲍曼不动杆菌主要携带armA型16SrRNA甲基化酶耐药基因。米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦对多重耐药鲍曼不动杆菌有较好的抗菌活性,而多重耐药鲍曼不动杆菌对其他多种抗生素呈多重耐药性。     

特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化

目的以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法并优化。方法以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件。得到最优PCR反应条件后,将该方法用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法的有效性和特异性。结果共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94℃预变性4 min,94℃变性40 s,54.5℃退火20 s,72℃延伸40 s,24个循环,最后延伸1 min;特异性分析发现此方法能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断。结论成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌。     

16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的：运用16SrRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法：提取细菌DNA,采用通用引物PcR扩增16SrRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果：12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。结论：16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

基于16S rRNA序列鉴定临床不常见细菌

目的以16S rRNA基因为靶序列,建立核糖体测序方法鉴定临床不常见细菌。方法利用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S rRNA基因,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn分析。结果10株临床常见细菌测序结果与表型鉴定符合,检测出4株临床不常见细菌。结论 16S rRNA基因测序可以作为鉴定临床不常见细菌的重要方法之一。     

聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因

根据细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的高度保守性,设计合成所有细菌、革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的共同引物,采用聚合酶链反应检测已知细菌１３株,三对引物分别扩增的阳性率为１００％,倍比稀释法能检出细菌的最低浓度为４ＣＦＵ·ｍｌ－１,同时检测临床样本４０份,阳性率为６７５％（２７／４０）,同期细菌培养阳性率为４５％（１８／４０）,二者比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结果提示聚合酶链反应检测细菌１６ＳｒＲＮＡ基因具有高度的特异性和敏感性。     

鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的检测

目的了解耐氨基糖苷类药物鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行情况。方法收集2008年1月—2009年4月临床分离对阿米卡星和庆大霉素耐药的鲍曼不动杆菌70株,PCR（聚合酶链反应）方法扩增5种甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD）,PCR产物进行电泳分析和测序。统计菌株对亚胺培南等12种抗生素的耐药率。结果 armA基因的检出率为68.6%,未检出rmtB、rmtA、rmtC和rmtD基因。所有菌株对除亚胺培南外其它抗生素的耐药率均大于80%。结论 16S rRNA甲基化酶（armA亚型）基因广泛存在于这些耐药菌株中。这些对阿米卡星和庆大霉素耐药的菌株,对其它抗生素的耐药也十分严重。     

聚合酶链反应检测细菌16SrRNA基因

根据细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的高度保守性,设计合成所有细菌,革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的共同引物,采用聚合酶链反应检测已知细菌１３株,三对引物分别扩增的阳性率为１００％,倍比稀释法能检出细菌浓度为４ＣＦＵ．ｍｌ＾－１,同时检测临床样本４０份,阳性率为６７．５％,同期细菌培养阳性率为４５％,二者比较差异有显著性。     

新生儿肠炎粪肠球菌16S rRNA鉴定分析

目的:分离和鉴定新生儿肠炎患儿便血中的病原菌,结合临床诊断,分析新生儿肠炎病因.方法:对2例新生儿肠炎病例的便血标本进行研究,(1)直接涂片镜检观察鉴定;(2)菌株纯化筛选;(3)采用CTAB提取法提取菌株的DNA,并通过PCR扩增菌株16S rRNA序列,将所获得的序列与GenBank数据库进行BLAST比对;(4)采用Kirby-Bauey纸片扩散法进行药物敏感试验.结果:(1)便血标本共分离纯化2株可疑菌株;(2)通过16S rRNA序列与GenBank数据库进行BLAST比对,两株菌株的序列与粪肠球菌的相似度达(99％);(3)分离的粪肠球菌对氨苄西林敏感性较高.结论:新生儿肠炎是由粪肠球菌感染引起,标本直接镜检与药敏试验有利于早期诊断及抗生素的合理应用.     

16S rRNA基因序列鉴定标本中病原细菌的方法学研究

目的研究16S rRNA基因序列鉴定标本中病原微生物的关键技术,评价序列分析技术作为病原微生物检测方法的可行性和实用件。方法对117份不同来源的临床标本分别采用形态学、细菌培养、16S rRNA基因扩增与测序分析,比较不同方法对病原菌检出的灵敏度与特异性。分子技术通过改良的微量核酸提取方法,扩增16S rRNA基因两个区域（BSF8-BSR534和BAK11 w-BAK2）。结果细菌培养和PCR检测的阳性率分别是49％（57／117）和72％（84／117）,63％（53／84）的PCR产物通过直接测序鉴定到种;60例（52％）培养阴性标本中有7例（12％）经序列分析再次鉴定出病原菌;形态学检查阳性率为64％（75／117）,与PCR结果接近,两者结合可提供推测性报告。第1对引物（扩增区：BSF8-BSR534）较适合革兰阳性细菌分类,第2对引物（扩增区：BAK11w-BAK2）对临床常见病原菌均可获得理想的序列。结论改进核酸提取技术、筛选恰当的引物、优化基因扩增和测序流程,通过16S rRNA基因序列直接鉴定标本中病原微生物有着广阔的应用前景。     

细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用

目的:构建细菌16S rRNA基因芯片,并将其应用于细菌检测.方法:根据细菌16S rRNA基因保守区设计合成针对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌的通用探针,以及针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的特异性探针,并构建基因芯片.利用所构建的芯片检测相应细菌,并观察其特异性及敏感性.结果:成功构建了相应的基因芯片;所构建的基因芯片能准确检出相应细菌,无交叉阳性现象,检测时间约需6 h;所构建的基因芯片能检测出DNA含量为15 fg的大肠埃希菌基因组DNA.结论:细菌16S rRNA基因芯片可用于细菌的检测,具有良好的特异性及敏感性,且耗时少.     

白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16S rRNA序列测定与分析

【目的】PCR法扩增与测定白纹伊蚊和致倦库蚊的细胞内共生菌 Wolbachia16SrRNA序列 ,分析其种系发生关系及传播方式。【方法】从单只雌蚊中提取DNA ,PCR法扩增 16SrRNA序列 ,扩增产物进行克隆及测序。【结果】从白纹伊蚊和致倦库蚊分别扩增出Wolbachia 16SrRNA序列 ,并克隆入 pGEM T载体 ,测序证明两序列长度分别为 897bp。【结论】成功克隆了白纹伊蚊和致倦库蚊Wolbachia 16SrRNA序列。测序和同源性分析表明 ,它们之间的同源性为 99 9%,提示Wolbachia在白纹伊蚊和致倦库蚊可能存在水平传播的方式。