蛋白酶体抑制剂对中脑脑片的毒性作用及其机制研究

目的:观察蛋白酶体抑制剂对体外培养的大鼠中脑脑片黑质多巴胺(DA)能神经元的早期毒性作用,利用这种新型的组织模型探讨蛋白酶体功能异常在帕金森(PD)发病中的作用。方法:制备Wistar大鼠体外中脑黑质脑片的长期培养体系,加入蛋白酶体抑制剂lactacystin(0.1,0.5,1.0,5.0μmol/L)作用24 h后,测定培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活力水平观察脑片活力。TH免疫组化观察黑质细胞变性缺失,α-synuclein免疫组化观察α-synuclein的表达,TUNEL法检测多巴胺能神经元凋亡。结果:经0.1,0.5,1.0和5.0μmol/L浓度的lactacystin作用24 h后,脑片黑质部位TH阳性神经元数量减少,α-synu-clein表达率增加,凋亡检测显示,5.0μmol/L的lactacystin组部分黑质细胞出现TUNEL染色阳性。结论:蛋白酶体抑制剂lactacystin对脑片中DA能神经元具有毒性作用,能诱导黑质细胞凋亡,其作用具有浓度依赖性。蛋白酶体功能缺陷在帕金森病发病机制中可能发挥重要作用。     

溶酶体抑制剂对小鼠行为学与黑质多巴胺神经元的影响

目的 初步探讨溶酶体抑制剂对小鼠行为学及多巴胺神经元功能的影响.方法 于小鼠右侧中脑黑质(SN)区,立体定向微量注入溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂.观察阿朴吗啡诱导的小鼠旋转行为改变以及行为学变化;检测黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数.结果 阿朴吗啡未能诱导出小鼠旋转行为.蛋白酶体抑制剂组为10～15圈.多巴胺损害程度与溶酶体的剂量相关.磷酸氯喹25 μmol/L时多巴胺神经元几乎没有损害作用;50 μmol/L时局部区域多巴胺神经元有轻微损害;100 μmol/L时损害明显;200 μmol/L时黑质区注射局部神经元损害最严重,黑质注射区未见有神经元存在.1～4周呈现出较为明显逐渐恢复的特点.结论 溶酶体功能抑制与多巴胺神经元凋亡相关,不同剂量溶酶体抑制剂在不同时间对多巴胺神经功能的损害不同.     

蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用

目的:观察蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用.方法:8周龄C57BL/6小鼠随机分组:磷酸盐缓冲液(PBS组)和lactacystin组,二种制剂分别单侧立体定向注射于中脑前脑束(Middle forebrain bundle);12周龄时灌注取脑分离纹状体,采用HPLC法测多巴胺、5-HT及代谢产物,取中脑观察黑质区多巴胺能神经元变性及包涵体样物质形成情况.结果:Lactacystin组同侧黑质区多巴胺细胞数减少51%,并可见泛素染色阳性的类包涵体样物质形成,同侧纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)浓度分别减少52%、46%和51%,而5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)浓度无改变.结论:蛋白酶体抑制剂可引起选择性黑质区多巴胺能神经元变性,并可能导致细胞内异常蛋白质聚集.     

蛋白酶体功能障碍对多巴胺能PC12细胞的特异性损伤

目的探讨蛋白酶体抑制剂lactacystin对多巴胺能PC12细胞的特异性损伤。方法不同浓度的lactacystin(1、5、10、15和20μmol/L)分别处理多巴胺能PC12细胞和胶质瘤U251细胞24 h,MTT法检测细胞活力;50μmol/L的lactacystin处理U251细胞24 h,MTT法检测细胞活力;10、20μmol/L lactacystin处理PC12细胞,W estern B lot检测细胞内多泛素化蛋白含量;单胺氧化酶B抑制剂selegiline(500μmol/L)和特异性酪氨酸羟化酶抑制剂-αMT(1 mmol/L)提前4 h预处理PC12细胞,再与10μmol/Llactacystin共同作用24 h,MTT法检测细胞活力,W estern B lot检测多泛素化蛋白含量。结果Lactacystin呈剂量依赖性损伤多巴胺能PC12细胞,其对胶质瘤U251细胞无毒性作用,而且其毒性与细胞内多泛素化蛋白生成增加相关。用以增加细胞内多巴胺含量的selegiline和用以减少细胞内多巴胺含量的α-MT都导致lactacystin毒性增强。结论蛋白酶体功能障碍特异性损伤多巴胺能细胞,而其特征性的神经递质多巴胺在其易感性中的作用复杂。     

蛋白酶体功能障碍对多巴胺能PC12细胞的特异性损伤

目的探讨蛋白酶体抑制剂lactacystin对多巴胺能PC12细胞的特异性损伤.方法不同浓度的lactacystin(1、5、10、15和20μmoL/L)分别处理多巴胺能PC12细胞和胶质瘤U251细胞24 h,MTT法检测细胞活力;50 μmol/L的lactacystin处理U251细胞24 h,MTT法检测细胞活力;10、20 μmol/L lactacystin处理PC12细胞,Western Blot检测细胞内多泛素化蛋白含量;单胺氧化酶B抑制剂selegiline(500μmol/L)和特异性酪氨酸羟化酶抑制剂α-MT(1 mmol/L)提前4 h预处理PC12细胞,再与10 μmol/Llactacystin共同作用24 h,MTT法检测细胞活力,Western Blot检测多泛素化蛋白含量.结果Lactacystin呈剂量依赖性损伤多巴胺能PC12细胞,其对胶质瘤U251细胞无毒性作用,而且其毒性与细胞内多泛素化蛋白生成增加相关.用以增加细胞内多巴胺含量的selegiline和用以减少细胞内多巴胺含量的α-MT都导致lactacystin毒性增强.结论蛋白酶体功能障碍特异性损伤多巴胺能细胞,而其特征性的神经递质多巴胺在其易感性中的作用复杂.     

自噬参与6-羟基多巴胺诱导多巴胺能神经元死亡的实验观察

目的 观察自噬在6-9基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的大鼠多巴胺能神经元中的激活,初步探讨自噬在多巴胺能神经元死亡中的作用.方法 用脑立体定位黑质致密部给药法建立6-OHDA介导帕金森病大鼠模型,用透射电镜法观察多巴胺能神经元中自噬激活,免疫荧光法检测6-OHDA对多巴胺能神经元中LC3表达的影响.结果 透射电镜显示,6-OHDA注射后6h至24h,被损伤大鼠黑质致密部神经元内溶酶体被激活,自噬小体形成.免疫荧光法显示模型大鼠与对照组相比,黑质多巴胺能神经元受损,TH阳性细胞明显减少,LC3表达量显著增加.结论 自噬参与6-OHDA介导的多巴胺能神经元死亡过程.     

α - 突触核蛋白与帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）又称特发性帕金森病,也称为震颤麻痹（paralysis agitans,shaking palsy）,是一种多发于老年人的神经系统退行性疾病,也是中老年人最常见的锥体外系疾病。65 岁以上人群患病率为1%,随年龄增高,男性稍多于女性。帕金森病的病因尚未明确,其发病机制包括线粒体功能障碍、氧化应激、快速兴奋性递质谷氨酸的毒性作用等。其典型病例特征为黑质多巴胺能神经元变性缺失和神经元包浆内嗜酸性包涵体路易小体的形成,而α- 突触核蛋白淀粉样纤维聚集体是PD患者大脑中路易小体的主要成分。尽管目前对于α-突触核蛋白与帕金森的关系尚未完全清楚,但研究表明α-突触核蛋白的聚集与路易小体的形成及多巴胺能神经元的死亡有着密切关系。近年来,越来越多的研究揭示了α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用。①α-突触核蛋白在正常生理状态下并没有细胞毒性,但基因或者环境的改变极易引起α-突触核蛋白发生错误折叠,同时其二级结构可因环境的改变而出现动态变化,蛋白质出现寡聚体,纤维性蛋白逐渐增多,可溶性改变,继而导致路易小体出现,最终导致多巴胺能神经元受损;②α-突触核蛋白寡聚体的聚集可以影响突触小泡的循环和小泡膜的通透性,从而影响突触囊泡的完整性和胞内多巴胺水平,最终导致多巴胺能神经元的死亡;③α-突触核蛋白的过表达可诱导线粒体功能失常,降低蛋白酶体的活性,从而增加了线粒体对凋亡刺激的敏感性,引起ATP生成减少和活性氧的生成增加,活性氧能引起多巴胺能神经元的死亡,也能对α-突触核蛋白进行硝化修饰,亚硝酸化的α-突触核蛋白既能促进寡聚体的形成又能稳定已经形成的寡聚体,导致多巴胺能神经元损伤的恶性循环;④α-突触核蛋白的聚集形式能够与多种蛋白质相互作用,其中包括选择性的与蛋白酶体相互结合并降低其降解活性,导致异常蛋白的数量易超过泛素-蛋白酶体系统的降解能力而产生聚集,继而促进路易小体的形成,最终可导致PD的发生。α-突触核蛋白与帕金森病的发生有着紧密联系,降低α-突触核蛋白的聚集有利于帕金森病症状的缓解及减缓其进程。本文将综述α-突触核蛋白与PD的关系及其在PD发病中的作用。     

谷氨酸对小鼠胚胎中脑原代细胞培养中多巴胺能神经元损伤的时程效应

目的：探讨谷氨酸兴奋性损伤诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤的时程效应,阐明谷氨酸兴奋性毒性在帕金森病(PD）模型中对多巴胺能神经元损伤的作用。方法：取孕14 d小鼠胚胎的中脑组织制备成细胞悬液,进行原代培养,分为对照组和谷氨酸用药组。细胞在体外培养第10天,加入500 μmol·L^-1谷氨酸并作用15 min,分别于用药后2、 4、 6、24 和48 h进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学染色。在显微镜下计数TH染色阳性神经元数量及每个神经元突起数量。结果：对照组中每个培养孔多巴胺能神经元的数量平均为（778.0±18.6）个,谷氨酸用药组2、4、6、24 和 48 h多巴胺能神经元数量平均为（306.0±8.6）、（314.0±15.4）、（298.0±19.1）、（307.0±18.5）及（323.0± 23.8）个。谷氨酸用药各组中多巴胺能神经元数量较对照组明显减少(P<0.05),但谷氨酸用药组2、4、6、24 和 48 h多巴胺能神经元数量比较差异无显著性(P>0.05)。随机选取每组100个多巴胺能神经元的突起进行计数,对照组多巴胺能神经元的突起数量平均为（3.440±0.106）个,谷氨酸用药组2、4、6、 24 和 48 h时多巴胺能神经元突起数量分别为（2.240±0.105）、（2.390±0.103）、（3.070±0.105）、（3.420±0.987）和 （3.420±0.923）个。谷氨酸用药后2和4 h多巴胺能神经元的突起数量较其他各组均明显减少(P<0.05)。结论: 谷氨酸可在体外诱导小鼠胚胎中脑原代培养中多巴胺能神经元的损伤和死亡,是一个相对急性、不可逆的损伤过程,但随着损伤后恢复时间的延长,损伤的多巴胺能神经元形态可恢复。     

帕金森病的病因和治疗研究进展

帕金森病 (ＰＤ)是一种常见的神经系统变性疾病 ,该病主要病理改变为中晚黑质多巴胺能神经元的消失 ,其原因至今仍不清楚。由于多巴胺自动氧化时产生的醌、半醌和氧自由基可以损伤黑质神经元[1 3 ] ,因此 ,多巴胺可能作为内毒素参与ＰＤ的发病 ,依赖还原性辅酶ＥＩ ＩＩ醌氧化还原酶 (ＮＱ0 1 )是一种黄素酶 ,它催化醌双电子还原反应 ,从而减少氧自由基的产生[4] 。有研究发现 ,ＮＱ0 1可能和氧化反应对多巴胺神经元起保护作用[5] 。该酶的活性高低可能与多巴胺自动氧化时氧自由基的产生量有关。最近的研究发现 ,ＮＱ0 1基因ｃＤＮＡ序列的…     

不同剂量蛋白酶体抑制剂对缺血后神经元的作用

目的:探索蛋白酶体抑制剂在不同剂量时对缺血后脑组织的作用及原因.方法:使用大鼠单侧大脑中动脉栓塞模型,50只大鼠随机分成5组,梗塞3小时后注入不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132,定时进行神经功能评分、TIC染色、TUNEL染色、Western blot检测Casepase 8蛋白表达.结果:MG132治疗有效缩小脑梗死体积,1mg/Kg组凋亡细胞数目最少,Casepase 8表达与MG132剂量相关.结论:蛋白酶体抑制剂对缺血区神经元的保护作用局限于低剂量效应,高剂量下对神经元有促凋亡作用.蛋白酶体抑制剂的保护作用可能通过Casepase 8途径起作用.     

MPP+诱导小鼠胚胎中脑组织原代培养多巴胺能神经元的损伤与死亡

目的：探讨1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（1-methyl-4-phenyl-[BF]1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPP⁺）诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤。方法：采用OF1/SPF小鼠胚胎（孕14 d）中脑进行原代细胞培养，将培养细胞分为对照组和MPP⁺给药组。于体外培养第10天,在MPP⁺给药组分别加入含有0.1、1.0、10.0 和15.0 μmol•L^-1 ４个不同浓度的MPP⁺的培养液，持续作用48 h后，经酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色，显微镜下观察、计数多巴胺能神经元。 于体外培养10 d,在MPP⁺给药组的培养液中加入终浓度为10 μmol•L^-1MPP⁺,分别于给药后2、4、8、24、48、72和96 h进行TH免疫组化染色，显微镜下计数TH染色阳性神经元，明确MPP⁺引起多巴胺能神经元损伤和死亡的时程变化。结果：0.1、1.0、10.0和15.0 μmol•L^-1浓度的MPP⁺给药组中平均每培养孔中的TH染色阳性神经元的数量分别为对照组的(70.30±6.38)%、(67.39±4.92)%、(51.68±2.95)% 和(50.91±5.60)% 。MPP⁺给药组中，多巴胺能神经元的损伤表现为两种不同形态:绝大多数多巴胺能神经元表现为神经突起的数目及长度明显减少，极少数为胞体空虚、丢失,仅存神经突起。10 μmol•L^-1 MPP⁺分别作用24、48、72和96 h的MPP⁺给药组中,TH染色阳性神经元的数量每培养孔分别为(677.2±6.1)、(411.5±26.6)、(229.0±20.3)和(191.3±15.2)个，与对照组［(839.8±15.5)个/培养孔］相比明显减少（P<0.05）。 结论: 0.1、1.0、10.0和15.0 μmol•L^-1 浓度的MPP⁺均可诱导的多巴胺能神经元的损伤和死亡，其损伤程度与MPP⁺药物浓度和持续作用的时间呈依赖关系；MPP⁺诱导多巴胺能神经元的损伤和死亡可能存在2种不同的机制。     

氧化应激在锰神经毒性中的作用

长期的锰暴露,可以引起锥体外系的神经损伤,出现类帕金森病的临床症状。虽然锰的神经毒性作用机制至今还不清楚,但是已有的研究表明其很可能与机体内的氧化应激状态有关。本文将从锰诱导的氧化应激对线粒体的损伤、对多巴胺能神经元及对体内钙、铁离子代谢影响的研究进展作一综述。     

胞二磷胆碱对1-甲基-4-苯基吡啶诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用

目的：探讨胞二磷胆碱对1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺)诱导的多巴胺能神经元数量减少及形态学改变的影响。方法：体外原代培养怀孕第14 天小鼠胚胎中脑神经元，采用MPP⁺（10 μmol•L^-1）在体外建立多巴胺能神经元损伤细胞模型。实验分为对照组、单纯MPP⁺药物组及5个不同浓度胞二磷胆碱（0.01、0.101.00、10.00和100.00 μmol•L^-1）与MPP⁺共同给药组。应用酪氨酸脱氢酶免疫化学染色方法观察不同浓度胞二磷胆碱对MPP⁺诱导多巴胺能神经元损伤的形态及数量的变化。结果：体外培养第12天，单纯MPP⁺药物组中多巴胺能神经元的数量明显少于对照组（P<0.05）；0.10μmol•L^-1和100.00μmol•L^-1 胞二磷胆碱治疗组，多巴胺能神经元的数量分别高于单纯MPP⁺药物组(11.83%和21.26%)（P<0.05）。0.10和100.00 μmol•L^-1胞二磷胆碱加MPP⁺药物组中多巴胺能神经元的突起长度明显高于单纯MPP⁺药物组（P<0.05）。结论：胞二磷胆碱可有效地防止MPP⁺的多巴胺能神经元的损伤和死亡，可能为帕金森氏病的防治提供一个新途径。     

帕金森病体外实验细胞模型的建立

目的： 探讨1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（MPP⁺ ）对小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元的毒性作用及其机制。在体外建立帕金森病（PD）实验研究的细胞模型。方法：采用小鼠胚胎（孕14 d）中脑进行原代细胞培养，实验分为对照组和不同浓度(0.1、１、10和15 μmol•L^-1)MPP⁺药物实验组，应用酪氨酸羟化酶（TH）免疫化学细胞染色方法 和Hoechst33342荧光染色对多巴胺能神经元的损伤及凋亡进行测定。结果：对照组中多巴胺能神经元的数量为(875±23)个/孔。在0.1、１、10和15 μmol•L^-1 MPP⁺实验组，多巴胺能神经元的数量分别为(612±25)、(586±32)、(459±16)和(435±19)个/孔，与对照组比较，MPP⁺实验组多巴胺能神经元数量均明显降低（P<0.05）,多巴胺能神经元突起的数目和长度明显减少。Hoechst33342 染色发现，对照组中凋亡细胞数占总细胞数的(5.45±0.29)%,10 μmol•L^-1 MPP⁺药物治疗组细胞凋亡率为(26.97±1.36)%，显著高于对照组水平（P<0.05）。结论：0.1、１、10 和15 μmol•L^-1 MPP⁺均引起多巴胺能神经元的数量显著减少，随着药物浓度的增加，多巴胺能神经元减少的程度越显著。MPP⁺引起的多巴胺能神经元的变性死亡可能通过凋亡途径所诱导。     

抗氧化剂对帕金森病的保护作用及机制的进展

帕金森病(PD)是以黑质多巴胺能神经元变性为特征的中枢退行性疾病。研究表明氧化应激反应对PD神经元死亡起促进作用,减少氧化应激可阻止疾病的恶化。本文简要综述了氧化应激在PD发病中的作用,及现有用于PD的抗氧化药物,如多巴胺受体激动剂、还原型谷胱甘肽、人参皂苷Rg1、维生素E和银杏叶提取物的概况。     

VHL抑制剂对鱼藤酮所致帕金森病秀丽隐杆线虫模型的影响

为了研究VHL(von Hippel-Lindau)抑制剂对帕金森病(Parkinson′s disease,PD)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis ele?gans,C.elegans,简称线虫)模型的影响,采用鱼藤酮诱导PD线虫模型,并使用VHL抑制剂VH298进行干预.以不同浓度的鱼藤酮对转基因线虫zc...     

人参防治帕金森病的研究进展

归纳总结了帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的研究概况、人参防治帕金森病的药理作用及其有效成分人参皂苷在保护黑质多巴胺能神经元方面相关作用机制的研究进展,为人参在防治帕金森病方面的合理应用奠定了基础。人参皂苷可能通过拮抗氧化应激反应、抑制钙通道和阻断引起神经元凋亡的多条信号通路等机制,保护多巴胺能神经元。