PLK1在食管癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨PLK1在食管癌组织内的表达水平及其与临床病理转移、分期、类型间的关联性。方法:收集2010年2月-2014年2月在我院接受手术切除的食管癌患者的食管癌和正常食管组织（距离食管癌＞5cm的癌旁组织）的切除标本（包埋于石蜡中）。比较两种组织的PLK1表达情况,并探讨PLK1表达与食管癌组织的组织分化程度、肿瘤分级、临床分期、T分期以及淋巴结转移情况之间的相关性。结果:本研究共纳入食管癌患者60例,包括食管癌及正常食管组织各60个。食管癌组织的PLK1阳性表达率显著高于正常食管组织（P<0.01）;不同组织分化（P=0.045）、肿瘤分级（P<0.01）、淋巴结转移情况（P=0.024）所对应的肿瘤组织PLK1的阳性表达率差异具有统计学意义。结论:PLK1在食管癌组织的表达明显高于癌旁正常食管组织,且PLK1的表达与食管癌的分级、组织分化程度以及淋巴结转移情况有显著的相关性。     

CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的： 应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的CYP2E1 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制 研究。     

慢病毒介导RNA干扰Pin1异构酶的鼻咽癌稳定细胞株的建立和鉴定

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立稳定表达siPin1的鼻咽癌细胞株。方法:将对照组病毒液lv-3和实验组病毒液siPin1感染CNE2细胞,通过嘌呤霉素和绿色荧光检测筛选siPin1稳定细胞株,在荧光显微镜下观察细胞的荧光表达,通过定量PCR和Western blot鉴定siPin1细胞Pin1 mRNA和蛋白的表达。结果:筛选siPin1稳定表达细胞株嘌呤霉素筛选浓度为1μg/ml,病毒感染后超过90%细胞发出绿色荧光,实验组siPin1与对照组lv-3相比,Pin1 mRNA表达水平下降,Western blotting检测Pin1蛋白表达明显减少。结论:成功构建Pin1干扰的稳定表达鼻咽癌细胞株,为后续研究提供工具细胞。     

稳定过表达miR-224 的胰腺黏液性囊腺癌MCC1 细胞株的建立

目的：构建hsa-microRNA-224(miR-224)过表达慢病毒载体,建立稳定过表达miR-224 的胰腺黏液性囊腺癌MCC1 细胞株。方法：设计miR-224 前体过表达基因片段,应用qRT-PCR 法扩增目的基因片段,通过基因重组技术将目的基因片段插入GV369 慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析。用GV369-miR-224 慢病毒感染胰腺黏液性囊腺癌MCC1 细胞,建立稳定过表达miR-224 的MCC1 细胞株。荧光显微镜下观察GV369-NC及GV369-miR-224 慢病毒表达载体的转染效果,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MCC1、GV369-miR-224-MCC1 和GV369-NC-MCC1 组细胞中miR-224 的表达水平。结果：成功构建GV369-miR-224 慢病毒表达载体质粒。GV369-miR-224-MCC1、GV369-NC-MCC1 细胞在荧光显微镜下均发出绿色荧光。miR-224 表达水平在GV369-miR-224-MCC1 细胞中显著高于阴性对照GV369-NC-MCC1 细胞和空白对照MCC1 细胞(23.45±1.94 vs 2.11±0.38,1.46±0.11,均P<0.01),而两组对照组之间miR-224 表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：成功构建稳定过表达miR-224 的胰腺黏液性囊腺癌MCC1细胞株,为探讨miR-224在胰腺黏液性囊腺癌中的功能及发病机制提供新的细胞模型。     

一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统

目的：建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响。方法：采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率。应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素（Dox）诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1（MTA1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、转化生长因子β1（TGFB1）、上皮型钙黏附素1（CDH1）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）mRNA的表达水平。结果：重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1：1或2：1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%。应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达。其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组（不加Dox诱导）的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高（P均 < 0.05）,而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低（P均 < 0.05）。结论：成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础。     

基于3T3-L1细胞株的人类ADRB1基因稳定过表达模型的构建

目的:构建ADRB1基因稳定过表达的细胞模型。方法:将ADRB1 cDNA克隆片段和慢病毒载体连接;将重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集上清液感染3T3-L1前脂肪细胞,利用GFP流式分选法筛选稳转细胞株。结果:Western blot检测证明,ADRB1过表达组的ADRB1蛋白水平显著高于mock组。结论:基于3T3-L1细胞株的ADRB1基因稳定过表达模型构建成功,为研究ADRB1在肿瘤恶病质脂肪消耗中的作用奠定了基础。     

稳定敲降NF-YB基因HeLa细胞系的构建

目的：利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术,构建稳定敲降NF-YB基因的HeLa细胞系。方法：设计shRNA-NF-YB引物,利用分子克隆技术构建H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB质粒,转染293T后收集病毒感染HeLa细胞;用嘌呤霉素筛选细胞得到稳定敲降细胞株;利用Western blot和实时荧光定量PCR对细胞系进行鉴定。结果：构建的质粒经测序后与设计的引物对比序列一致,Western blot和实时荧光定量PCR结果表明构建细胞的NF-YB蛋白和mRNA表达抑制效果明显。结论：本实验成功构建了NF-YB-shRNA-HeLa细胞系,获得了特异性NF-YB基因敲降的HeLa细胞。     

CDK2AP1 基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建CDK2AP1基因慢病毒过表达载体,感染人口腔鳞癌细胞系SCC-25细胞系中,为CDK2API基闲体内外实验研究奠定实验基础。方法：将pCDH—CMV—GFP慢病毒载体sall和XbaI酶切位点插入CDK2APl基因序列,构建pCDH—GFP—CDK2API慢病毒质粒。经PCR鉴定、测序验证CDK2API基因后,将其和慢病毒包装质粒混合物共同转染病毒包装细胞293TN,转染24小时后产生藿组病毒GFP—CDK2API慢病毒颗粒。经病毒浓缩纯化后,感染SCC-25口腔鳞痛细胞系并测定感染效率。结果：GFP—CDK2AP1病毒中携有转染正确的CDK2API璀因,感染人SCC-25细胞系后能稳定表达。结论：成功地在舌鳞癌细胞系SCC-25中构建了CDK2APl基因的重组慢病毒过表达载体,为研究其住头颈鳞癌的生物学功能奠定基础。     

稳定敲降NF-YB基因HeLa细胞系的构建

目的：利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术,构建稳定敲降NF-YB基因的HeLa细胞系。方法：设计shRNA-NF-YB引物,利用分子克隆技术构建H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB质粒,转染293T后收集病毒感染HeLa细胞;用嘌呤霉素筛选细胞得到稳定敲降细胞株;利用Western blot和实时荧光定量PCR对细胞系进行鉴定。结果：构建的质粒经测序后与设计的引物对比序列一致,Western blot和实时荧光定量PCR结果表明构建细胞的NF-YB蛋白和mRNA表达抑制效果明显。结论：本实验成功构建了NF-YB-shRNA-HeLa细胞系,获得了特异性NF-YB基因敲降的HeLa细胞。     

人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达

[目的]构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况。[方法1根据Genebank数据库提供的人Egr—1启动子基因序列,设计-对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆。RT—PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MVX线照射对CD基因表达的影响。f结果1经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3．1（＋）-Egr．1．CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT—PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高,尤以15Gy组CDmRNA的表达水平最高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降。[结论]pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株．建立了基因表达与放射的剂量效应关系．为后续的临床应用研究奠定基础．     

Lentiviral shRNA screen of human kinases identifies PLK1 as a potential therapeutic target for osteosarcoma

We describe an optimized systematic screen of known kinases using osteosarcoma cell lines (KHOS and U-2OS) and a lentiviral-based short hairpin RNA (shRNA) human kinase library. CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay was used to measure cell growth and survival. We identified several kinases, including human polo-like kinase (PLK1), which inhibit cell growth and induce apoptosis in osteosarcoma cells when knocked down. cDNA rescue and synthetic siRNA assays confirm that the observed phenotypic changes result from the loss of PLK1 gene expression.     

RhoB对胃癌细胞SGC7901的负性调控作用

目的研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法用PCR扩增出RhoB的全长cDNA，构建RhoB可诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB；脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中，筛选出稳定抗性克隆；Western blot检测米非斯酮诱导后转染细胞中RhoB蛋白的表达。用MTT assay检测RhoB转染细胞株的生长速度、双苯并咪唑染料(Hoechst 33258)活细胞吸收分析法、流式细胞仪(FCM)检测RhoB对胃癌细胞凋亡指数作用。结果成功构建RhoB可诱导真核表达载体pGene／V5-His-RhoB，并经酶切和测序鉴定；转染后经潮霉素B和Zeocin筛选出稳定抗性克隆SGC7901／RhoB；米非斯酮诱导出RhoB蛋白表达，在诱导24小时后蛋白表达最高；细胞增殖试验结果显示，RhoB表达上调后胃癌细胞增殖受到抑制；细胞凋亡检测提示高表达RhoB可明显诱导胃癌细胞凋亡。结论RhoB对胃癌细胞增殖具有负性调控作用，可诱导胃癌细胞出现凋亡。     

食管癌细胞系KYSE150中RNA干扰MTA1的基因芯片分析

目的探讨MTA1对食管癌转移相关基因的影响。方法用RNA干扰的方法在食管癌细胞系KYSE150中沉默MTA1基因的表达,随后进行转移相关基因芯片分析。以两次芯片分析中均上调2倍以上(或下调1/2)为差异显著基因。通过DIVID生物信息学数据库进行gene ontology的通路分析。结果在两次基因芯片分析中均有意义上调的基因共有7个,分别是LAMC1、MMP14、MMP15、MDM2、API5、ODC1、PTGS2;而两次均显著下调的基因共有14个,它们是CSF1R、HGF、IGF2、ITGA6、MMP9、MMP11、MMP13、CASP8、CTSD、TMPRSS4、THBS2、TIMP1、ENPP2、SNCG。通过在DAVID生物信息学数据库中对上述表达差异显著的基因进行通路分析,结果提示差异基因主要富集在5条信号通路上,分别是肿瘤信号通路(MDM2、CASP8、CSF1R、HGF、ITGA6、LAMC1、MMP9、PTGS2)、ECM受体整合信号通路(LAMC1、THBS、ITGA6)、基质金属蛋白酶信号通路(TIMP1、MMP9)、小细胞肺癌信号通路(ITGA6、Cox2)和黏着斑信号通路(ITGA6、HGF、IGF2)。结论 MTA1参与了转移相关的一系列分子改变事件,尚需进一步的分子生物学方法验证这些基因调控的信号途径。     

PLK1表达与子宫内膜癌的生物学行为及预后的关系

目的探讨PLK1在子宫内膜癌组织中的表达,及其表达与子宫内膜癌临床病理因素和预后的关系。方法采用免疫组化S—P法检测PLK1在子宫内膜癌组织中的表达,并分析其表达与子宫内膜癌临床病理因素间的关系和对预后的影响。结果PLK1在子宫内膜癌组织中的阳性表达率为18．0％,主要呈胞浆染色。PLK1表达与子宫内膜癌的FIGO分期（P=0．04）和肿瘤细胞的分级（P=0．01）密切相关,与肿瘤复发转移（P=0．07）介于临界状态。PLK1阳性表达者的5年生存率明显低于阴性表达者（67．2％VS．82．4％,P=0．076）,但二者差异介于临界状态。COX分析显示PLK1表达不是子宫内膜癌患者的独立预后指标（P=0．761）。结论PLK1在子宫内膜组织中呈高表达,可作为肿瘤细胞增殖和分化程度的标志物,且可能成为子宫内膜癌预后的潜在标志物,但需进一步严格分层研究。     

小窝蛋白-1和E-钙黏蛋白在食管癌TE1细胞系中的表达及其意义

目的:检测小窝蛋白-1(Cav-1)和E-钙黏蛋白(E-cad)在食管癌TE1细胞系中的表达水平,探讨Cav-1在食管癌转移中可能的作用及机制。方法:化学合成针对Cav-1基因3个不同靶点的siRNA(Cav-1 siRNA1,Cav-1 siRNA2和对照siRNA),分别转染食管癌TE1细胞系,以未转染细胞为空白对照,转染对照siRNA细胞为阴性对照。采用Western blot法检测RNA干扰后TE1细胞中Cav-1和E-cad的表达情况;Transwell方法检测各组细胞的迁移和侵袭能力。结果:Western blot检测结果提示,与空白对照组比较,Cav-1 siRNA使食管癌TE1细胞系中Cav-1表达水平降低(P<0.01),E-cad表达水平升高(P<0.01);Transwell迁移及侵袭试验结果提示转染Cav-1 siRNA后细胞的迁移、侵袭能力较空白对照组显著减弱(P<0.05)。结论:Cav-1可能通过调节E-cad的表达影响食管癌的转移。