食管鳞癌ECA109细胞中Survivin通过ERK信号通路调控c-myc基因表达的机制

目的：探讨在食管鳞癌ECA109细胞中Survivin对c-myc基因的调控作用。方法：将食管鳞癌ECA109细胞分为Survivin shRNA干扰组、阴性质粒对照组（Control shRNA）和空白细胞株（未加任何处理的食管癌ECA109细胞）,将2μg Survivin shRNA质粒、2μg Control shRNA质粒分别转染ECA109细胞,48 h后收集各组细胞,采用RT-PCR法检测各组Survivin、c-myc mRNA的表达,Western blot法检测Survivin、c-myc蛋白及p-ERK蛋白的表达;采用ERK、p38、JNK、JAK/STA3、PI3K/Akt信号传导通路的特异性抑制剂分别阻断ECA109细胞中关键激酶的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达。结果：与阴性质粒对照组和空白细胞组比较,Survivin shRNA组Survivin表达下调,c-myc mRNA及蛋白的表达降低,差异均具有统计学意义（P均 < 0.05）;采用ERK、p38、JNK、JAK/STA3、PI3K/Akt信号通路抑制剂分别作用于食管癌ECA109细胞,PD98059（ERK信号通路阻断剂）组c-myc mRNA及蛋白表达降低（P < 0.05）;Survivin shRNA干扰沉默Survivin基因后ERK磷酸化蛋白表达降低（P < 0.05）。结论：Survivin对c-myc具有正向调控作用,可能通过ERK信号传导通路调控c-myc的表达。     

RNA干扰53BP1基因表达对食管癌放射敏感性的影响

背景与目的:细胞周期检测点激酶53BP1在细胞周期调控方面发挥着重要的作用,对体细胞的正常生长没有明显的调节作用,但在DNA损伤发生后被激活,引起细胞周期阻滞。本研究利用RNA干扰技术降低食管癌细胞ECA109细胞53BP1基因表达,观察其对放射线照射后细胞周期和放射敏感性的影响。方法:针对53BP1 mRNA序列,设计合成3对有效的干扰序列(siRNAl、siRNA2和siRNA3)和阴性对照序列,与载体pSIH1-H1-copGFP连接形成重组质粒,瞬时转染细胞,实时PCR(real-time PCR)和Western blot检测53BP1的表达,筛选有效干扰序列,与慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞,收集病毒液,感染ECA109细胞,获得稳定转染细胞系,命名为ECA109/B,转染空载体组命名为ECA109/N。采用real-time PCR和Western blot测定53BP1在mRNA水平和蛋白水平的表达。采用MTT、流式细胞术和克隆形成实验检测RNA干扰53BP1基因对ECA109细胞放射敏感性的影响。结果:成功构建p53BP1-shRNA质粒,3对干扰序列对人53BP1基因的表达在mRNA和蛋白水平显著低于阴性对照组和空白对照组,尤以siRNA1组效果最明显,取干扰效果最好的siRNA1,利用慢病毒包装系统,共同转染293T细胞,收集病毒液,感染ECA109细胞,荧光显微镜下挑取阳性克隆,扩大培养,获得稳定转染细胞株ECA109/B,53BP1基因在mRNA和蛋白表达水平亦低于对照组;MTT结果表明53BP1低表达对细胞的增殖无明显影响,用流式细胞术分析显示5 Gy射线照射后,ECA109/B的G2/M期比例明显低于阴性对照组和空白对照组;克隆形成实验的结果显示ECA109、ECA109/N、ECA109/B细胞的D0值分别为3.06、2.90和2.07 Gy;SF2值分别为0.91、0.89和0.79;Dq值分别为1.59、1.47和1.21,可见ECA109/N、ECA109放射敏感性未见明显差异,而ECA109/B细胞的放射敏感性高于ECA109/N、ECA109。结论:RNA干扰技术可以有效地抑制食管癌细胞ECA109中53BP1基因的表达,从而增强ECA109细胞的放射敏感性。     

CHK1和CHK2 shRNA转染对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响

目的 观察RNA干扰细胞周期检测点激酶CHK1和CHK2表达对食管癌细胞照射后G2期阻滞的影响。方法 CHK1和CHK2基因各选择4段序列分别设计合成短发卡状RNA（shRNA）,分别与pENTR^TM／U6质粒连接后转染Eca109食管癌细胞。采用Western blotting检测CHK1和CHK2蛋白表达,RT-PCR检测其mRNA表达,流式细胞仪检测5Cy照射后细胞周期变化,克隆法检测5Cy照射后细胞存活率。结果 CHK1和CHK2基因各成功建立4个序列的shRNA连接质粒,转染Eca109细胞后均使其蛋白表达降低。用抑制效果最好的CHKI和CHK2shRNA转染Eca109细胞后,其mRNA表达下降;在转染后72h,子一代细胞CHK1和CHK2蛋白仍明显降低,并使5Cy照射后1h的CHK2-T68磷酸化水平降低,而对CHK1-S345磷酸化水平无明显影响。CHK1 shRNA转染的Ecal09细胞在5Gy照射后12h时,明显减轻G2期阻滞程度;转染后72h和5Cy照射后12h,子一代Eca109细胞G2期阻滞仍明显低于单纯5Gy照射组;而CHK2shRNA转染不影响照射后C2期阻滞。CHK1和CHK2shRNA转染可降低5Gy照射后Eca109细胞存活率。结论 shRNA转染对CHK1和CHK2蛋白表达的抑制效应至少可以持续3d,且可传递给子代细胞;CHK1 shRNA转染可以减轻Eca109细胞照射后G2期阻滞,增加放射敏感性。     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的：以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法：将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果：腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论：采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。     

靶向沉默RNF2基因对食管癌细胞放射敏感度的影响

目的 探讨RNF2基因表达对X射线照射后食管癌细胞放射敏感度的影响。方法 针对RNF2mRNA序列,设计合成3对有效的干扰序列（siRNA1、siRNA2和siRNA3）和阴性对照序列。瞬时转染细胞,分别命名为RNF2 siRNA1组、RNF2 siRNA2组、RNF2 siRNA3组,转染空载体组和未转染组分别命名为NC组和control组。RT-PCR和Western blot法观察食管癌ECA109细胞各组中RNF2表达变化。MTT法检测RNF2基因对ECA109增殖能力的影响。克隆形成实验检测RNF2对ECA109放射敏感度的影响。流式细胞术测定RNF2基因干扰后对细胞周期和凋亡分布的影响。结果 3对干扰序列组的RNF2基因在mRNA和蛋白表达水平低于control组和NC组,尤以siRNA1组效果最明显。选择siRNA1作为干扰组进行MTT和流式细胞术检测。MTT结果表明照射后干扰组细胞增殖明显受抑;克隆形成实验的结果显示干扰组的的D0、Dq、SF2显著低于control组和NC组,而干扰组的外推数N（extrapolation number N）值明显高于后者,可见干扰组细胞的放射敏感度高于control组和NC组;流式细胞术显示照射后RNF2 siRNA组G0/G1期明显高于control组和NC组,S期显著低于control组和NC组。结论 siRNA干扰技术有效地抑制了食管癌ECA109细胞中RNF2基因的表达,联合X线照射后显著抑制了细胞增殖,消除了细胞周期阻滞在S期,增加了食管癌的放射敏感度。     

RNA干扰MDC1基因对食管癌细胞X线照后细胞周期及相关蛋白表达影响

目的 利用RNA干扰技术降低食管癌细胞ECA109中MDC1基因表达, 观察照射后细胞周期和放射敏感性变化并探讨相关机制。方法 针对MDC1mRNA序列设计合成3对有效干扰序列和阴性对照序列, 与载体pSIH1-H1-copGFP形成重组质粒, RT-PCR和蛋白印迹法测定MDC1mRNA和蛋白水平表达。克隆形成实验检测细胞放射敏感性, 流式细胞术检测细胞周期, 蛋白印迹法检测CHK1、CHK2蛋白表达, 激光共聚焦显微镜观察细胞核内MDC1斑点数量。单因素方差分析组间差别。结果 成功构建pMDC1-shRNA质粒并感染ECA109细胞, 获得稳定转染细胞ECA109M。ECA109M细胞MDC1mRNA、蛋白表达水平低于ECA109N、ECA109细胞(P=0.032、P=0.041)。5 Gy照射后ECA109M细胞G₂+M期比例低于ECA109N、ECA109(P=0.026)。5 Gy照射后ECA109、ECA109N、ECA109M细胞中CHK1和CHK2蛋白表达相近(P=0.345和P=0.451), ECA109M细胞CHK2T68蛋白表达低于ECA109、ECA109N细胞(P=0.012)。ECA109细胞D₀值为3.06 Gy, SF₂值为0.91;ECA109N、ECA109M细胞的D₀值分别为2.90、1.88 Gy;SF₂值分别为0.89、0.84(P=0.021;P=0.037)。结论 RNA干扰降低MDC1蛋白表达后可以降低细胞周期相关蛋白的表达, 解除细胞周期阻滞, 增强食管癌细胞ECA109的放射敏感性。     

慢病毒介导的RNAi沉默食管癌Eca109细胞MDC1基因表达对裸鼠移植瘤放射敏感性的影响

目的 研究抑制MDC1基因的蛋白表达对裸鼠移植瘤的影响,观察裸鼠肿瘤病理组织学和细胞生物学特征的变化。方法 根据MDC1 mRNA序列,设计合成3对有效的干扰序列和阴性对照序列,并与载体pSIH1-H1-copGFP形成重组质粒,RT-PCR和蛋白印迹法测定MDC1 mRNA和蛋白表达水平,筛选出阴性转染组(ECA109-N)、MDC1转染组(ECA109-M)细胞,将其接种裸鼠分为ECA109-M、ECA109-N、ECA109组,上述各组又分为⁶⁰Coγ射线照射组和未照射组。观察各组裸鼠移植瘤照射后体积变化,蛋白印迹法检测移植瘤组织中CHK1、CHK2、CHK2T68表达水平,流式细胞仪分析裸鼠肿瘤组织中细胞周期分布和细胞凋亡情况。多组样本均数间的比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果 成功构建pMDC1-shRNA质粒并转染ECA109细胞,获得稳定转染细胞ECA109-M。所有接种裸鼠均成活并在接种后1周左右可见裸鼠爪下形成移植瘤,各组之间肿瘤大小相近(P>0.05)。15 Gy照射后单纯照射组和空载照射组裸鼠的肿瘤生长速度慢于未照射组(P<0.05),其中MDC1转染联合照射组较阴性对照组和空白组肿瘤相对生长速率降低(P<0.05),生长抑制率升高(P<0.05)。MDC1转染联合照射组q值为1.36。MDC1转染联合照射组裸鼠体内CHK1和CHK2的蛋白表达水平相近(P>0.05),但CHK2T68磷酸化水平明显降低(P<0.05),各组裸鼠肿瘤组织中细胞周期分布和凋亡细胞比例也相近(P>0.05)。结论 RNA干扰降低MDC1蛋白表达后可有效增强细胞的放射敏感性,表现为抑制了⁶⁰Coγ射线照射后裸鼠移植瘤的生长速度。     

Survivin shRNA重组慢病毒构建及对A549细胞增殖的影响

背景与目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成员,在多种肿瘤组织中高度表达而在终末分化细胞中极少表达,因此可以作为癌症治疗的理想靶点.本研究旨在通过构建Survivin基因shRNA的慢病毒质粒并干扰肺癌细胞A549中Survivin的表达,分析其对细胞增殖的影响.方法 设计Survivin干扰靶序列,构建重组质粒;将pLL3.7-Survivin转染293T细胞后利用Hela细胞检测病毒的滴度并感染A549细胞,应用RTPCR和Western blot检测干扰效果;MTT与流式细胞术分析其对细胞增殖的影响.结果 本研究成功构建了重组质粒;重组质粒可抑制A549细胞中Survivin基因的表达;细胞受阻于G2/M期.结论 本研究构建的重组质粒可抑制Survivin基因的表达并影响细胞的增殖,其为研究RNAi介导的肺癌基因治疗打下基础.     

靶向EGFR的干扰RNA对卵巢癌耐药细胞凋亡的影响

目的：探讨RNA干扰表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表达对多药耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDP凋亡的影响。方法：构建携带EGFR小发夹干扰RNA(small hairpin RNA, shRNA)的重组表达载体（pEGFRshRNA）,脂质体法转染入SKOV3/DDP细胞,同时设未转染对照组和非特异性干扰质粒CtrlshRNA对照组。RTPCR和免疫细胞化学法检测转染后SKOV3/DDP细胞内EGFR mRNA和蛋白的表达;流式细胞仪分析EGFR沉默后SKOV3/DDP细胞周期和凋亡率的变化。结果：与转染对照质粒组相比,转染pEGFRshRNA组细胞EGFR mRNA和蛋白的表达明显受抑制(P<001)。流式细胞仪检测结果显示：顺铂作用24 h后,pEGFRshRNA转染组细胞周期分布发生明显改变,与对照组和CtrlsiRNA组相比,G0/G1期细胞比例和凋亡率明显增加（P<0.01）,而S期细胞比例显著降低（P<0.01);凋亡率显著升高。结论：靶向EGFR的干扰RNA可抑制SKOV3/DDP细胞中EGFR的表达,调节耐药细胞周期,促进耐药细胞凋亡。     

RNA干扰沉默Survivin表达提高131I对甲状腺癌FTC-133细胞增殖的抑制作用

目的:探讨RNA干扰沉默Survivin表达对131I抑制甲状腺癌FTC-133细胞生长的作用及其机制。方法:采用脂质体法将Survivin-siRNA及其阴性对照NC-siRNA转染至干扰组和NC组细胞中,Real-time PCR和Western blot检测Survivin mRNA和蛋白的表达;以131I孵育后,MTT法、流式细胞仪检测Survivin对FTC-133细胞增殖、周期和凋亡的影响,Western blot检测细胞中CDK2、Cyclin E、Bax和Bcl-2蛋白的表达变化。结果:转染Survivin-siRNA成功沉默FTC-133细胞中Survivin mRNA和蛋白的表达,抑制FTC-133细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期和细胞凋亡,并下调细胞中CDK2、Cyclin E和Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白的表达;131I孵育后,干扰组细胞中的上述变化较NC组明显增强。结论:沉默Survivin表达可提高131I对FTC-133细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用,其作用机制可能与下调CDK2、Cyclin E、Bcl-2和上调Bax蛋白的表达有关。     

USP28在ECA109细胞中不同表达状态对照射后凋亡及相关蛋白表达影响

目的 采用基因转染技术观察USP28不同表达状态对ECA109细胞放射敏感性的影响,为食管癌的综合治疗提供理论依据。方法 qRT-PCR检测USP28和c-Myc在食管上皮细胞Het-1A、食管癌细胞ECA109和放射抗拒细胞ECA109R中的表达。针对USP28基因和c-Myc基因设计特异性siRNA序列,构建pcDNA-USP28和pcDNA-c-Myc质粒,转染食管癌细胞ECA109,观察转染效果及相关蛋白表达情况。6Gy X射线照射细胞,流式细胞仪检测各组的细胞凋亡情况。克隆形成实验评价放射敏感性。结果 USP28和c-Myc在ECA109中的表达高于正常的食管上皮细胞Het-1A (P<0.05),在ECA109R中的表达高于ECA109(P<0.05)。成功构建pcDNA-USP28和pcDNA-c-Myc重组质粒,转染结果显示与阴性对照组比较无论mRNA水平和蛋白水平,si-USP28组中USP28的表达明显下降,而在pcDNA-USP28组中USP28的表达明显上升。针对c-Myc的研究得到类似结果。与对照组比较,pcDNA-USP28组c-Myc在蛋白水平表达明显升高,si-USP28中c-Myc表达下降(P<0.05)。6Gy照射ECA109后pcDNA-USP28组细胞凋亡率下降,放射敏感性下降;ECA109R中si-USP28组是细胞凋亡率增加,放射敏感性增强。结论 USP28的蛋白表达与食管癌细胞的放射敏感性密切相关,其机制可能与USP28对c-Myc的表达调控有关。     

类泛素蛋白FAT10在食管癌中的表达及生物学作用

目的:探讨类泛素蛋白FAT10的异常表达在食管癌（esophageal carcinoma,ECA）进展中的作用机制。方法:采用RT-PCR和Western blot法检测FAT10在30例ECA标本中的mRNA和蛋白表达水平。siRNA技术干扰食管癌细胞ECA-109中FAT10表达后,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测ECA-109细胞周期和细胞凋亡的变化,Western blot检测Akt/GSK3β信号通路的变化。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,FAT10在食管癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调（P<0.05）。siRNA技术干扰ECA-109细胞中FAT10表达后,ECA-109细胞生长速度明显下降（P<0.05）。流式细胞术结果显示FAT10 siRNA干扰ECA-109细胞48h时,对细胞周期分布无明显影响（P>0.05）。但FAT10表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot检测到ECA-109细胞中Akt和GSK3β的磷酸化水平都明显下降。结论:FAT10基因在食管癌组织中表达上调,下调FAT10的表达能够抑制食管癌进展,机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。     

靶向Rap1b基因shRNA慢病毒载体的构建及其对食管鳞癌细胞Rap1b基因表达的沉默

目的:设计以Rap1b基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒表达载体并转染食管鳞癌细胞,观察其在食管鳞癌细胞中的表达。方法:应用重组DNA 技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA1/2/3/4。并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）及Western blot分别从mRNA 和蛋白水平检测转染食管鳞癌细胞株Eca109后Rap1b基因的表达情况。结果:测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×10⁹TU/ml,pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA3/4转染后72h和96h均可显著抑制Rap1b基因mRNA及蛋白的表达。结论:成功构建Rap1b基因的shRNA 慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制食管鳞癌细胞Eca109中Rap1b基因的表达。     

靶向沉默BMI-1表达对食管癌细胞放射增敏实验研究

目的 采用siRNA干扰技术降低食管癌ECA109细胞BMI-1基因表达,观察其对放射线照射后细胞增殖、迁移能力及周期和凋亡影响。方法 针对BMI-1 mRNA序列,设计合成有效的干扰序列命名为BMI-1 siRNA组,阴性对照序列命名为NC组,未转染组命名为对照组。采用RT-PCR和蛋白印迹法检测ECA109中BMI-1在mRNA和蛋白水平的表达;Transwell小室实验检测siRNA干扰BMI-1基因对ECA109迁移能力的影响;MTT、流式细胞术和克隆形成实验检测BMI-1对ECA109放射敏感性的研究。结果 照射后BMI-1 siRNA组BMI-1基因mRNA和蛋白水平显著低于对照组和空载组,且细胞增殖和迁移能力显著降低(P=0.024、0.000、0.025、0.031)。克隆形成实验显示对照组、NC组放射敏感性相近(P=0.569),而BMI-1 siRNA组细胞放射敏感性高于对照组和空载组(P=0.000)。流式细胞术分析显示照射后,BMI-1 siRNA组G₂+M期显著低于对照组和空载组(P=0.000);且细胞凋亡显著增加(P=0.000),而未照射组之间未见明显差异(P=0.350)。结论 siRNA干扰联合X线照射有效降低食管癌细胞ECA109中BMI-1基因表达,进而抑制亚致死性损伤修复而增加放射致死效率。     

EZH2基因对人食管癌细胞增殖的影响

目的:探讨过表达或沉默果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对食管癌细胞增殖的影响.方法:选用人食管癌细胞株ECA 109、TE1、KYSE30、KYSE 170作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blotting法分别检测食管癌细胞EZH2mRNA和蛋白的表达水平,然后采用qPCR检测过表达和沉默EZH2基因后对4株食管癌细胞EZH2mRNA的表达变化;CCK-8增殖实验、克隆形成实验检测过表达和沉默EZH2基因及EZH2抑制剂DZNep(3-deazaneplanocin A)处理对食管癌细胞增殖能力和克隆形成率的影响.结果:食管癌ECA 109、TE1细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平明显高于KYSE30、KYSE 170细胞(P＜0.05).食管癌TE1、ECA 109细胞转染EZH2-ShRNA后EZH2表达水平下调(均P＜ 0.05)、细胞增殖能力降低(1.07±±0.08 vs 1.59±±0.09,P＜0.05;0.88±0.08 vs 1.05±0.11,P＜0.05)、克隆形成数下调[(200.00±11.43) vs (480.00±±13.10)个,P＜0.05;(88.00±±8.16) vs (220.00±±±14.69)个,P＜0.05].KYSE30、KYSE 170细胞转染EZH2过表达质粒后EZH2表达水平升高(均P＜0.05)、细胞增殖能力显著增强(1.06±0.07 vs 0.76±0.06,P＜0.05;3.36±±0.30 vs 1.50±0.08,P＜0.05)、克隆形成数显著升高[(45.00±3.27) vs (18.00±±1.63)个,P＜0.05;(65.00±4.08) vs (23.00±±2.45)个,P＜0.05];DZNep处理后,ECA109和TE1细胞增殖能力降低(均P＜0.05)、克隆形成数下降(均P＜0.05).结论:EZH2基因能有效促进食管癌细胞的增殖和克隆形成能力,为深入研究EZH2作为食管癌治疗的新靶点提供了实验研究基础.