重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

目的：基于重叠延伸PCR (SOE PCR)技术构建转录因子EB (TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E. coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段...     

用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法：用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物,对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定,并用NC-BI Blast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果：5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出约260 bp的产物,PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100%;2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物,而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物,核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99%,在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论：常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫;从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异,导致与特异性引物结合能力的差异,可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

菊花和野菊花位点特异性聚合酶链式反应的鉴别研究

目的:研究菊花和野菊花药材的DNA分子鉴别方法。方法:提取菊花和野菊花样品的总DNA,利用Gen Bank数据库中菊花和野菊花的trn L-trn F序列,使用Bio Edit软件进行序列比对,找出具有稳定差异的变异位点,根据变异位点利用Primer premier 5软件设计菊花特异性鉴别引物,并对位点特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法进行条件优化。结果:用菊花特异性鉴别引物对所有样品进行PCR扩增,可以将菊花和野菊花予以区分。结论:通过位点特异性PCR的方法初步实现了菊花和野菊花药材快速、准确的鉴别。     

PCR直接测序法在脓肿分枝杆菌鉴定中的应用

目的探讨聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S r RNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S r RNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息;针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S r RNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段,但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp;部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息,并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌,并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

广地龙特异性引物序列的设计及其混伪品的鉴别

目的?通过设计特异性引物来鉴定广地龙及其混伪品。方法?提取广地龙及其混伪品的DNA。利用通用引物COⅠ序列对广地龙及其混伪品进行PCR扩增,并对扩增产物进行双向测序。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,找出广地龙的变异位点,设计出广地龙的特异性引物,用于广地龙及其混伪品的鉴定。对PCR反应条件退火温度、循环次数、DNA模板量和Taq酶用量进行适应性考察。结果?COⅠ序列不存在特异性,不同物种、不同品种的动物药均可扩增出750?bp大小的片段,无法鉴定广地龙及其混伪品。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,设计出广地龙的特异性引物PA-f/PA-r。在建立的PCR反应体系中,只有广地龙可以获得574?bp的基因片段,其他混伪品未扩增出相应条带。结论?设计的广地龙特异性引物可以准确、成功鉴别广地龙,与其他混伪品区分,为广地龙的品种鉴别提供了有效的方法。      

嗜人按蚊rDNA-ITS2基因的克隆鉴定及SNP分析

目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA（rDNA）第2内转录间隔区（ITS2）序列,研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性（Single Nuclear Polymorphism,SNP）。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板,利用蚊虫5．8s和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,扩增产物经回收纯化后连接到TA载体,经amp^＋LB固体平板筛选的阳性克隆。经amp^＋LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因。纯化后重组克隆经PCB鉴定可重现556bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99．6％,其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入,在556的范围内有一个A→T,一个G→T的颠换;一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守,但不同个体间也存在一定的SNP多态性。     

中国农大小型猪胰淀素基因部分未知序列扩增与分析

目的扩增中国农大小型猪IAPP基因序列,分析其序列结构特点。方法提取中国农大小型猪血液基因组DNA,设计3对特异性引物进行PCR扩增,产物鉴定、测序和同源性比对分析。结果成功扩增出中国农大小型猪IAPP基因的1028bp的序列。结论经同源性比对分析显示,中国农大小型猪与人的IAPP基因的同源性为77%。     

吉林省常见的5种委陵菜trnL-F序列比对

目的 用PCR扩增5种吉林省常见委陵菜trnL-F序列,对其PCR产物进行序列分析,找出其序列的差异,为委陵菜种间鉴别及鉴定提供科学依据.方法 分别从5种吉林省常见委陵菜的叶片中提取总DNA,以trnL-F特异性引物进行扩增,扩增产物经纯化后直接测序.结果 5种委陵菜内trnL-F序列完全一致.而不同种委陵菜间ITS序列差异明显.结论 不同种委陵菜间trnL-F序列有明显差异,因此trnL-F序列分析及其衍生的方法可用于不同委陵菜的种属鉴别.     

中西医临床专业形态实验改革对学生动手能力的影响

<正>人体解剖学、组织学与胚胎学及病理学,属于基础医学课程中的形态学学习范畴,近年来,由于基础课学时缩短,加大了这些基础课程的学习难度,众所周知,实践教学是医学院校整体教学工作重要的组成部分[1-5]。随着教学改革的不断深入,笔者大胆实践,开展了以提高动手能力和实践创新能力为导向的实验课教学改革,将形态学课程中的实验教学部分进行整合,在原有课时不变的基础上,增加综合实验内容,充分提高学生的动手能力,并     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的: 构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品。方法: 用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果: PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上。结论: 本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品。     

多聚酶链反应鉴别致病性与非致病性的溶组织内阿米巴虫株

多聚酶链反应是体外DNA增殖的新技术。在多聚酶、dNTP和引物的参与下在数小时内使特异性的DNA顺序大量增殖。用B、C、G、T4株溶组织内阿米巴的DNA增殖30周期后,作凝胶电泳分析,发现致病性虫株的引物不能使B、C、G、T虫株的DNA增殖,凝胶电泳不出现条带;而非致病性虫株的引物能使B、C、G、T虫株的DNA增殖,凝胶电泳出现特异性条带。用辣根过氧化物酶标记致病性虫株DNA探针与B、C、G、T的DNA进行斑点杂交呈阴性反应;而用非致病性虫株DNA探针与B、C、G、T的DNA斑点杂交呈阳性反应。实验结果显示B、C、G、T为非致病性虫株,与同工酶分析一致。多聚酶链反应是鉴别致病性和非致病性溶组织内阿米巴虫株的高特异性和敏感性方法,为从分子生物学研究溶组织内阿米巴的致病机理提供一新技术。     

AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果:AS-PCR可检测CYP2C19基因多态性,引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论:建立和优化的AS-PCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

基于ITS序列的紫芝分子鉴定

目的 建立基于ITS序列的紫芝分子鉴定方法.方法 分析20株灵芝属菌株ITS序列,设计紫芝的特异性引物.结果 用此引物对20株灵芝属菌株的DNA进行扩增,只有2株紫芝菌株有目的扩增条带.结论 设计的特异性引物有很高的专属性,能高度特异地鉴定紫芝菌株.     

先天致畸病原体感染多重PCR检测方法的建立

目的：建立先天多种病原体（ＴＯＲＣＨ）感染的多重ＰＣＲ诊断方法。方法：选择弓形虫、巨细胞病毒、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒特异性基因片段,按照多重ＰＣＲ引物设计的特殊要求,各设计一对引物,以四种病原体标准株为模板进行扩增。找出各病原体最佳扩增条件,再进行综合分析,最终找到一个理想的多得扩增条件,结果：各病原体扩增片段及多重ＰＣＲ扩增条带均清晰、均一,产量较高,无非特异扩增,片段长度与理论值一致;ＤＮＡ测