特异性抑制单核细胞中EMMPRIN基因表达的siRNA筛选和鉴定

目的 设计合成干扰细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN表达的siRNA.方法 根据人源EMMPRIN mRNA的序列,设计合成3对不同的且能干扰EMMPRIN基因表达的siRNA,将其转染THP-1单核细胞株,采用荧光定量PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况.结果 设计合成的3对siRNA中的2对siRNA可以特异性抑制单核细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达(分别减少70%和50%,P＜0.05).结论 成功设计合成了针对EMMPRIN基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断EMMPRIN表达的siRNA,为进一步研究EMMPRIN基因对动脉粥样硬化形成的影响及其临床应用奠定了基础.     

siRNA抑制survivin的表达诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的研究

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构建有效siRNA的表达载体,转染卵巢癌SKOV-3细胞,分析sur-vivin基因的表达及细胞凋亡情况。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA,能显著下调SKOV-3细胞内的survivin表达,并导致SKOV-3细胞凋亡。结论利用RNA干扰能有效抑制survivin基因表达并诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡,为进一步的靶向survivin分子的体内抗肿瘤研究奠定了基础。     

大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定

目的 应用特异性siRNA抑制新生SD大鼠心房肌细胞Kit3.1基因表达;筛选出干扰效率最高的siRNA,并应用分子生物学方法进行鉴定.方法 设计并化学合成3条针对Kir3.1基因的siRNA,脂质体法转染原代培养的新生SD大鼠心房肌细胞.应用Real-time PCR筛选出抑制效率最高的siRNA,将其转染入细胞;于转染后24 h、48 h、72 h提取细胞总RNA及蛋白质,分别采用Real-time PCR和Westem blot检测Kir3.1 mRNA及蛋白质表达情况.,结果 Real-time PCR显示siRNA-3干扰效率强于siRNA-1,2,能够显著下调心房肌细胞Kir3.1 mRNA的表达;siRNA-3转染心房肌细胞后,发现其在24,48,72 h均能使Kir3.1 mRNA及蛋白表达下降.结论 针对Kir3.1 mRNA合成的siRNA能够特异性干扰Kir3.1基因表达和蛋白质的合成,这可能为心律失常性疾病的治疗提供新的实验性依据.     

体外筛选针对大鼠Toll样受体4 mRNA的小分子干扰RNA序列

目的:筛选能高效干扰大鼠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)mRNA的最佳小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列.方法:克隆大鼠TLR4基因全长,将TLR4基因与含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的质粒pEGFP-C1重组,构建pEGFP-rTLR4,化学合成法合成3对干扰大鼠TLR4的siRNA后,将3对siRNA、阴性对照siRNA和干扰EGFP的siRNA分别与pEGFP-rTLR4经Lipofectamine2000共转染HEK-293细胞株,通过倒置相差显微镜和流式细胞仪观察EGFP的荧光强度.结果:与阴性对照组相比,3对针对TLR4的siRNA及针对EGFP的siRNA均明显抑制EGFP的荧光表达(P＜0.05).其中尤以siRNA2(核苷酸序列为5'-GTC TCA GAT ATC TAG ATC T-3',位于TLR4基因序列的1 352～1 370位)的抑制效果最强,干扰效率＞75%.结论:成功筛选出体外可高效干扰大鼠TLR4mRNA的siRNA片段.     

MCP-1siRNA真核表达载体的构建及其对HKCMCP-1基因沉默效应的鉴定

目的构建单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)特异性小分子干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,研究siRNA对人肾小管上皮细胞(HKC)MCP-1基因的沉默作用。方法采用基因克隆技术,将合成的MCP-1特异性siRNA插入真核表达载体pRNAT-U6/Neo中,构建MCP-1 siRNA真核表达载体。将pRNAT-MCP-1质粒以脂质体法转染HKC,24 h后应用实时定量RT-PCR技术检测HKC内MCP-1 mRNA水平的表达情况。结果成功构建MCP-1siRNA真核表达载体,转染MCP-1 siRNA的HKC,24 h后HKC内MCP-1 mRNA水平表达明显降低,抑制效率达90%以上。结论构建的RNA干扰真核表达载体能够高效抑制HKC的MCP-1基因表达,为肾间质纤维化的防治研究奠定了实验基础。     

小干扰RNA分子对乙肝病毒复制的抑制作用研究

目的 筛选特异高效抗乙型肝炎病毒(HBV)的小干扰RNA分子(siRNA),评价其干扰效果.方法 在HepG2.2.15细胞内导入筛选的3条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平;Western blot检测细胞上清中乙肝表面抗原(HBsAg),分析siRNA对HBV基因表达的抑制作用.结果 导入特异siRNA分子细胞中HBV的mRNA表达量明显降低(P＜0.05),上清中HBsAg含量显著减少.阴性对照细胞中HBV的mRNA含量和上清中HBsAg含量基本不变(P＞0.05).结论 所筛选的siRNA分子能特异性抑制HBV的mRNA和蛋白的合成.     

RNA干扰对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖的影响

目的 探讨针对人端粒酶RNA(hTR) 及其催化亚基(hTERT) 的小干扰RNA (siRNA) 对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响. 方法 根据人TR mRNA和TERT mRNA的序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA(TR-siRNA, TERT-siRNA),通过脂质体法将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量PCR分析TR、TERT mRNA 表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,MTT 法检测细胞增殖. 结果 3对TERT-siRNA和3对TR-siRNA中,pRNAT-TERT-Ⅲ和pRNAT-TR-Ⅲ可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达(分别减少67%和41%,P<0.05),且BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性明显受到抑制. 结论 TR-siRNA和TERT-siRNA能特异且高效阻断各自基因表达,降低端粒酶活性,进而抑制BIU-87细胞的增殖.     

Bcl-2基因siRNA的筛选及对胃癌细胞MGC-803增殖的影响作用

目的:筛选有效抑制Bcl-2基因表达的siRNA序列,研究Bcl-2特异性siRNA对胃癌细胞的抑制作用。方法:设计并合成4对针对Bcl-2的siRNA序列,通过LipofectamineTM2000转染入人胃癌细胞MGC-803后,应用实时定量PCR和Western Blot法分别检测siRNA对细胞内Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平抑制效果,且经CCK-8法检测siRNA对胃癌细胞增值影响。结果:与对照组相比,所设计4对siRNA中siBcl-2抑制Bcl-2 mRNA和蛋白表达效果最佳,抑制率分别为88%和63%,且siBcl-2在转染后第96 h对癌细胞增殖有显著抑制效果。结论:成功筛选出1对能有效抑制Bcl-2基因表达的siRNA序列,为胃癌基因治疗提供实验依据。     

靶向抑制滑膜细胞TNF-α表达的siRNA筛选及鉴定

目的：设计并筛选能高效抑制创伤性关节炎滑膜细胞肿瘤坏死因子α（T N F‐α）表达的最佳干扰序列,为进一步研究TNF‐α基因对创伤性关节炎的临床应用奠定基础。方法根据人源 TNF‐α mRNA 的序列,设计合成3组不同的且能干扰 TNF‐α基因表达的小型干扰 RNA（siRNA）序列,将其转染人创伤性关节炎滑膜细胞,与阴性对照组（NC 组）比较。培养48 h 后,采用实时灾光定量 PCR（RT‐PCR）检测滑膜细胞 TNF‐α mRNA 表达水平,采用 ELISA 法检测细胞上清液 TNF‐α表达水平。结果与 NC 组相比,3组 siRNA 中有2组 siRNA 可有效使人滑膜细胞中 TNF‐α mRNA 表达减少（P＜0．01）;同时细胞上清液中 TNF‐α分泌量下降,与 NC 组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。结论成功设计合成了特异且高效阻断 TNF‐α表达的 siRNA 。     

siRNA下调Smad3基因后对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶表达的影响

目的以Smad3基因为研究对象,筛选出该基因的有效siRNA干扰载体,并探讨下调表达Smad3基因对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶（ppGalNAcTs）家族mRNA水平表达的影响。方法将事先构建的3个带有荧光标记的干扰载体分别转染人肝星状细胞株（HSC）中,通过RT-PCR、Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平检测干扰效率。并通过转染有效的Smad3基因的siRNA表达载体,检测下调Smad3以后对糖基转移酶ppGalNAcTs家族mRNA表达的影响情况。结果成功筛选到Smad3基因的有效siRNA干扰载体,检测出转染了Smad3的siRNA表达载体的肝星状细胞中Smad3的mRNA和蛋白表达都受到了抑制,而糖基转移酶ppGalNAcTs的mRNA表达也随之发生了一些变化。结论成功筛选到一个Smad3基因的siRNA干扰载体,继而可转染人肝星状细胞,并抑制其中Smad3蛋白的表达,为研究siRNA方法在肝纤维化中的治疗作用提供了实验基础和理论支持。     

联合RNA干扰TR及TERT对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖的影响

目的 探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA(siRNA)、人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响.方法 根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TR-Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ),构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置pRNAT-TR-Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染BIU-87细胞株,采用荧光定量PCR分析hTR及hTERT mRNA表达,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖.结果 分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ,pRNAT-TR-Ⅲ及pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达(分别减少pRNAT-TERT-Ⅲ TERTmRNA:67%、pRNAT-TR-Ⅲ TRmRNA:41%、pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ TRmRNA:57%、pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ TERTmRNA:70%.P＜0.05).且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制,以联合RNA干扰尤为明显(pRNAT-TERT-Ⅲ:1.80±0.014,pRNAT-TR-Ⅲ:1.95±0.016,pRNAT-TERT-Ⅲ、pRNAT-TR-Ⅲ:1.25±0.012,P＜0.05).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长,为其临床应用奠定了基础.     

CD147慢病毒载体对兔外周血单核巨噬细胞的沉默作用

目的 设计合成干扰细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147)基因表达并筛选出能高效抑制兔外周血单核/巨噬细胞中CD147表达的shRNA慢病毒表达载体.方法 根据兔源CD147mRNA的序列构建慢病毒表达载体,实验分为6组:空白对照组,阴性对照组(NC),构建4对干扰CD147基因表达的shRNA慢病毒组(A、B、C、D),并转染兔外周血单核/巨噬细胞,72h后通过荧光显微镜观察转染效果,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Elisa,观察CD147mRNA和蛋白表达情况.结果 转染后72h收集细胞,空白对照组CD147mRNA相对表达量为(0.98±0.09),CD147蛋白表达(119.69±16.40)pg/ml,NC对照组(1.00±0.05)pg/ml及(115.66±13.88)pg/ml,4对shRNA慢病毒载体组分别为A组(0.42±0.03)pg/ml及(58.74±5.11)pg/ml、B组(0.56±0.04)pg/ml及(70.99±7.42)pg/ml、C组(0.63±0.08)pg/ml及(82.79±7.71)pg/ml、D组(0.53±0.04)pg/ml及(69.71±5.84)pg/ml.设计合成的4对shRNA慢病毒载体中A组可以特异性抑制巨噬细胞中CD147mRNA和蛋白表达,分别减少57.72%和50.92%(P<0.05).结论 成功构建了针对CD147基因的shRNA慢病毒载体,并从中筛选出能特异且高效阻断CD147表达的shRNA.     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在巨噬和泡沫细胞中的表达

目的观察细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)在单核向巨噬和泡沫细胞分化过程中的表达变化。方法体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬和泡沫细胞,应用Real-time RT-PCR和Western blot测定EMMPRIN基因和蛋白表达。结果单核细胞分化为巨噬细胞后EMMPRIN mRNA和蛋白表达均显著增加,当进一步分化为泡沫细胞时,EMMPRIN的表达与巨噬细胞比较无显著性差异。结论单核细胞向巨噬细胞的分化诱导EMMPRIN表达,而进一步向泡沫细胞分化对其表达无影响。     

乙肝病毒X基因阻断降低肝癌细胞HepG2.215与纤维连接蛋白的黏附

目的探讨乙肝病毒X基因（HBX）在肝细胞癌（HCC）侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hH1neo质粒,构建针对HBX的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3,转染肝癌细胞株HepG2.215,用荧光定量PCR仪检测siRNA对HBX mRNA表达的抑制作用,用Western blot法检测siRNA对HBX蛋白表达的抑制作用。以Transwell小室测定HepG2.215细胞与纤维连接蛋白（Fn）的体外黏附能力。结果成功构建shRNA表达载体,shRNA表达载体均可不同程度地抑制HBX的表达,其中psiRNA1对HBX的抑制作用最强,对HBX mRNA抑制率达80.27%,对HBX蛋白的抑制率为65.59%;细胞体外黏附能力受到明显抑制,在培养至48、72h后,对照组和转染组跨膜细胞数分别为442.6±57.1vs376.4±55.2和588.2±70.1vs513.6±68.5,两时相点均有明显差异（P〈0.05）。结论阻断HBX的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2.215的体外侵袭性生长。     

小分子干扰RNA抑制大鼠肾细胞Ppif基因的表达

目的 研究siRNA 对大鼠肾细胞(NRK)Ppif 基因的抑制作用.方法 根据大鼠Ppif 基因序列设计并化学合成3对siRNA 及1对阴性对照siRNA,并在5′端标记FAM 羧基荧光素,以Lipofectamine~(TM)2000 转染入大鼠肾细胞,用RT-PCR 和Western blot 分别检测Ppif 基因和蛋白表达量的改变,验证所设计的siRNA 的抑制效应.结果以Lipofectamine~(TM)2000转染所设计的siRNA 进入NRK 细胞,转染效率＞90%.起始于405、556位点的siRNA 在基因水平对Ppif 无明显抑制效应(P＞0.05),起始于198位点的siRNA 在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75.25%(P＜0.05);蛋白水平下降72.13 %(P＜0.05).结论 起始于198位点的siRNA 对大鼠肾细胞的Ppif 基因有明显的抑制效应.     

糖基化终产物对人单核细胞EMMPRIN基因表达的影响

目的:探讨糖基化终产物(AGEs)对人单核细胞细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的影响。方法:在培养的人单核细胞株中分别加入不同浓度AGEs干预24h和同一浓度AGEs干预不同的时间点,以1640培养基和相应浓度的牛血清白蛋白为对照组。用逆转录聚合酶链反应检测EMMPRIN mRNA的表达水平。结果:AGEs干预人单核细胞的EMMPRIN mRNA水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);且其表达呈时间和浓度依赖性降低(P<0.05)。结论:AGEs以时间及浓度依赖的方式减少人单核细胞EMMPRIN mRNA的表达。     

siRNA干扰对NIT-1细胞株G蛋白偶联受体40表达的影响

目的 利用siRNA技术抑制G蛋白偶联受体40（GPR40）在小鼠胰岛NIT-1细胞中的表达。方法 化学合成3对GPR40 siRNA 和1对FITC标记GAPDH siRNA, siPORT NeoFX 转染试剂介导siRNA转染到NIT-1细胞中,通过转染FITC标记GAPDH siRNA以优化转染条件,在优化条件下转染三对GPR40 siRNA, 分别于转染24、48和72 h后利用RT-PCR和western blotting 检测GPR40 mRNA和蛋白表达抑制率。 结果 根据优化的转染条件转染三对GPR40 siRNA, 三对siRNA均能有效降解GPR40的mRNA并进一步抑制其蛋白表达,这一作用持续72 h以上,其中siRNA1表现了最高的抑制效率。 结论GPR40 siRNA可高效、特异地抑制NIT-1细胞GPR40表达。     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

EMMPRIN在小鼠磨牙牙胚形态发生过程中的表达

目的 研究细胞外基质金属蛋白酶诱导因子EMMPRIN(basigin/CD147)在小鼠磨牙牙胚发育各阶段的表达,探讨其可能的生物学作用。方法 选择不同胎龄(E11、E13、E14、E15、E16、E18)和出生后1 d (P1)小鼠作为实验对象。Real-Time PCR定量检测小鼠牙胚发育各阶段下颌（E11和E13）及牙胚（E14、E15、E16、E18和P1）组织中EMMPRIN mRNA表达。原位杂交和免疫荧光染色观察EMMPRIN mRNA和蛋白在牙胚组织及相应发育阶段的颌面部发育器官中的定位表达。结果 Real-Time PCR结果显示,E13胎鼠下颌标本中EMMPRIN mRNA的表达约为E11胎鼠1.6倍(P<0.01); P1小鼠牙胚组织中EMMPRIN mRNA表达约为E14胎鼠的2倍（P<0.01）;EMMPRIN mRNA表达随牙胚组织发育呈现递增趋势。原位杂交和免疫荧光染色观察显示,在E14胎鼠牙胚组织中EMMPRIN mRNA和蛋白表达定位一致,但E15、E16、E18胎鼠 EMMPRIN mRNA与蛋白表达定位有所不同;相应发育时段胎鼠下颌骨的Meckel软骨（E14）、视网膜（E15）、大脑血脑屏障（E15）及颚骨骨化中心（E16）中EMMPRIN 蛋白表达均呈现强荧光信号。结论 EMMPRIN的表达贯穿于早期牙胚发生和发育的多个阶段,但牙胚发育帽状期和钟状期阶段EMMPRIN mRNA与蛋白表达并不完全一致。EMMPRIN有可能以外分泌或旁分泌方式,通过调控上皮间质的相互作用参与牙胚发育及形态发生。