转染趋化因子MCP-3基因诱导抗小鼠大肠癌主动免疫

背景与目的:趋化因子对于免疫细胞在肿瘤组织中的浸润起重要作用,转染趋化因子基因在许多类型的肿瘤中诱导了抗肿瘤免疫反应,本研究的目的是通过将趋化因子单核细胞趋化蛋白-3(monocytechemotacticprotein-3,MCP-3)基因转染小鼠大肠癌CMT93瘤细胞,探讨MCP-3用于诱导抗大肠癌主动免疫的可行性。方法:用脂质体将小鼠MCP-3基因导入小鼠大肠癌细胞CMT93,G418筛选抗性克隆,RT-PCR检测MCP-3的表达,趋化实验检测MCP-3的活性,体内实验观察野生型及MCP-3基因修饰瘤细胞的致瘤性,组织病理学检测肿瘤中免疫细胞的浸润及肿瘤的转移。结果:RT-PCR检测发现G418筛选得到的转染MCP-3的抗性克隆(CMT93/MCP3)表达MCP-3,而野生型CMT93不表达MCP-3。趋化实验显示CMT93/MCP-3的培养上清具有良好的趋化活性,趋化指数达5.57(P<0.05),对照组培养上清均无趋化活性。体内成瘤实验显示:与野生型瘤细胞相比,CMT93/MCP-3的成瘤率没有显著性下降,但源于CMT93/MCP-3的肿瘤生长速度与对照组相比显著减慢(P<0.05)。在CMT93/MCP-3所形成肿瘤中有明显的免疫细胞浸润,对照组肿瘤中免疫细胞的浸润较少。接种CMT93/MCP-3瘤细胞的小鼠,肿瘤的转移受到了显著性的抑制,转移率为0%(0/5),与对照组CMT93(100%,4/4)和CMT93/mock(80%,4/5)相比均有显著     

14-3-3β通过β- catenin 调控胶质瘤细胞的生长和增殖

目的：研究14-3-3β基因在胶质瘤细胞生长和增殖中的调控作用。方法：构建14-3-3β基因过表达质粒并设计14-3-3β基因和β- catenin 基因 siRNAs,分组转染人体正常神经星形胶质细胞系 SVGp12和胶质瘤细胞系 U87,噻唑蓝（MTT）法观察14-3-3β基因过表达/沉默和β- catenin 基因沉默对细胞生长和增殖的影响,并利用 qRT - PCR 定量分析受调控原癌基因的表达变化。结果：14-3-3β基因过表达的星形胶质细胞生长能力显著高于对照组（P ﹤0.05）,而β- catenin 基因沉默的星形胶质细胞生长受到明显抑制（P ﹤0.05）。观察到14-3-3β基因或β- catenin 基因沉默的胶质瘤细胞生长能力也显著低于对照组细胞（P ﹤0.05）。结论：胶质瘤细胞的生长和增殖受到14-3-3β基因的调控并且其调控是通过β- catenin 基因来进行的,但其具体的信号调控机制需要进一步探讨。     

MUC3诱导抗肿瘤免疫反应的实验研究

目的　探讨肿瘤粘液糖蛋白的核心多肽ＭＵＣ３诱导的抗肿瘤免疫反应。方法　测定多肽ＭＵＣ３ 免疫后小鼠的皮肤迟发性超敏反应（ＤＴＨ）和脾淋巴细胞的体外细胞毒反应。结果　ＭＵＣ３可以诱导小鼠的ＤＴＨ反应;体外脾淋巴细胞对ＭＵＣ３表达阳性的粘液腺癌细胞系,如人胰腺癌细胞株ＳＷ１９９０、人胃癌细胞株ＫＡＴＯ３都具有强的细胞毒作用,ＭＵＣ３的抗体Ｍ３Ｐ可以抑制体外鼠脾细胞的细胞毒作用。结论　ＭＵＣ３作为一类重要的肿瘤相关抗原,可以诱导小鼠的细胞免疫反应,并可能作为一有效的免疫原用于提高抗肿瘤免疫反应。     

趋化因子MCP-3协同B7诱导小鼠抗宫颈癌的主动免疫效果

目的：探讨趋化因子MCP－3能否增强B7基因诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫的效果。方法：实验组：将pCMV/MCP-3以基因药物的方式肌注615小鼠,同时用B7^ U14细胞疫苗在同一部位免疫小鼠,再将野生型U14移植入已免疫的小鼠。对照组A：用B7^ U14细胞疫苗＋生理盐水同时免疫615系小鼠;对照组B：用pCMV/MCP-3＋野生型U14免疫小鼠;其它处理同治疗组。观察3组小鼠的成瘤情况、生存期。用以上3种方案分别处理小鼠,2周后分别取脾T淋巴细胞用MTT法体外检测其对U14的杀伤率。结果：经方差分析比较3组在移植U14后不同时程瘤体平均体积有显著性差异（P＝91．86,P＜0．001）。3组平均生存期分别为100,63,37d,经Kaplan-Meier曲线比较,差异具显著性（P＜0．01）。体外检测经MCP－3和BU^ U14疫苗处理的小鼠,其T淋巴细胞在不同效靶比对U14的杀伤效率均明显高于经MCP－3和U14疫苗处理者（F＝40．62,P＜0．001）。结论：因子MPC－3能增强B7基因修饰的U14细胞疫苗的抗肿瘤效果,其增强作用需疫苗有B7的表达为前提。     

整合素αvβ3在脑胶质瘤的表达与肿瘤恶性程度的关系

 目的探讨整合素 αｖβ３与脑胶质瘤恶性程度之间的关系。方法应用免疫组化 ＳＡＢＣ法检测整合素 αｖβ３在 ４３例Ⅰ～Ⅳ级脑胶质瘤和 ＢＴ３２５人胶质瘤细胞系中的表达。结果Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤阳性率及高表达率均明显高于 Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤（Ｐ＜０．０５）。结论整合素 αｖβ３与脑胶质瘤恶性程度呈正相关，并可能对胶质瘤的侵袭性起正性调节作用     

趋化因子MCP-3基因和B7基因共转染诱导抗大肠癌主动免疫

目的：探讨趋化因子MCP－3（monocyte chemotactic protein-3）和B7基因共转染诱导抗大肠癌主动免疫的可能性。方法：用脂质体将小鼠MCP－3和B7（B7．1）基因导入小鼠大肠癌CMT93细胞，G418筛选抗性克隆，RT－PCR检测B7和MCP－3的表达，趋化实验检测MCP－3的功能。体内实验观察基因修饰瘤细胞（CMT93／B7＋MCP－3）的成瘤性、免疫小鼠后所诱导的针对CMT93的免疫保护及其作为疫苗治疗已形成肿瘤的疗效。结果；RT－PCR检测发现CMT93／B7＋MCP－3瘤细胞有B7和MCP－3的表达，而且所表达的MCP－3有良好的趋化活性。CMT93-/B＋MCP－3的成瘤性显著下降（P＜0．01）。经CMT93／B7＋MCP－3免疫的小鼠获得对CMT93的免疫保护（P＜0．05）。作为疫苗CMT93／B7＋MCP-3能抑制接种早期肿瘤的生长。结论：共转染MCP－3和B7基因能有效诱导抗大肠癌主动免疫，共转染的细胞作为疫苗治疗已形成的肿瘤有一定的疗效。     

B7基因转染的肿瘤细胞诱导的抗肿瘤免疫反应的特异性和持续性

肿瘤免疫治疗的目的之一是诱导特异性的T细胞反应以清除体内散在的肿瘤细胞，近年来的研究表明T细胞的激活除需要特异性抗原／MHC Ⅰ类分子复台物信号外，还需要共激活分子与T细胞表面的受体结台作为第二信号来完成整个过程，这类共激活分子中作用最明显的是BT分子，它与T细胞表面抗原CD28分子结合后，使T细胞分泌如IL-2等淋巴因子     

肿瘤粘液核芯肽MUC3诱导小鼠的免疫反应实验研究

我们采用凝胶过滤和密度梯度离心技术从胰腺癌细胞株SW1990细胞匀浆和细胞培养上清中提取了肿瘤粘液，用无水氢氟酸去掉糖链后，经鉴定为不含糖的肿瘤混合粘液核芯肽(MUC)，主要成份为MU-C1，MUC2和MUC3。动物实验表明具有诱发细胞免疫反应的作用，为分析混合粘液核芯肽诱发机体免疫功能的有效成份，我们用MUC3的合成肽作了进一步的实验研究。     

TNFAIP3和GRP78表达与鼻咽癌组织放疗敏感的相关性

目的:探讨TNFAIP3及GRP78在放射治疗鼻咽癌中的表达,研究其在放射治疗鼻咽癌中的意义。方法:取60例2006年1月13日-2006年11月26日第1次入院放射治疗的鼻咽癌患者,运用原位杂交方法检测放射治疗鼻咽癌中TNFAIP3及GRP78 mRNA的表达。结果:放疗敏感及放疗抗拒鼻咽癌中,TNFAIP3 mRNA中度及强阳性表达率分别为15.00%和45.00%,GRP78 mRNA中度及强阳性表达率分别为20.00%和47.50%,差异有统计学意义。放疗抗拒鼻咽癌中,TNFAIP3 mRNA中度及强阳性表达率与TNM分期呈正相关,III-IV期表达率为48.28%,I-II期表达率为36.36%。GRP78 mRNA中度及强阳性表达率与TNM分期呈正相关,III-IV期表达率为58.62%,I-II期表达率为18.18%,与T分期呈正相关,T3-T4期表达率为68.42%,T1-T2期表达率为28.57%。在有、无远处转移中,TNFAIP3 mRNA中度及强阳性表达率分别为81.81%和31.03%,GRP78 mRNA中度及强阳性表达率分别为72.73%和37.93%,差异有统计学意义。结论:TNFAIP3、GRP78参与了放疗抗拒鼻咽癌的发生和发展。     

外源性IFN-β基因对裸鼠SHG44胶质瘤的诱导凋亡研究

目的: 探讨β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及人β干扰素裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性和作用机制。 方法: 建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色以及电镜,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用。 结果: IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡。 结论: IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长并诱导胶质瘤细胞凋亡,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础。     

IFN-β基因诱导裸鼠胶质瘤Fas表达上调及细胞调亡的实验研究

目的研究β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及能否诱导胶质瘤细胞Fas表达上调,并探讨了β干扰素基因诱导细胞凋亡及Fas表达上调之间的联系.方法建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用以及胶质瘤细胞Fas表达情况.结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡,胶质瘤细胞Fas表达明显高于对照组.结论 IFN-β基因能够抑制人脑胶质瘤生长,并诱导胶质瘤细胞凋亡;IFN-β基因诱导胶质瘤细胞凋亡可能是Fas表达上调的结果.     

人脑胶质瘤中VEGF 和整合素ανβ3 的表达及相关性研究

 目的 研究血管内皮生长因子(VEGF)和整合素ανβ3(INT ανβ3)在不同病理级别人脑胶质瘤中的表达．并探讨两者之间的关系。方法 采用免疫组化SABC法和图像分析技术检测65倒不同病理级别人脑胶质瘤标本中VEGF和INT ανβ3的表达水平。结果 VEGF在不同级别胶质瘤中表达的平均光密度值(ALD)分别为0．05177±0．019683,0．07399±0．02798和0．09168±0．03671,INT ανβ3在不同级别胶质瘤中表达的平均光密度值(ALD)分别为0．04872±0．01869，0．06065±0．02998和0．08189±0．03953，差异均有显著性意义(P<0．05)．二者的表达水平呈正相关(r=0．835，P<0．01)。结论 VEGF和INT ανβ3在人脑胶质瘤中的表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关，两者之间呈正相关．提示二者在人脑胶质瘤的恶性生物学行为中起重要作用。     

IFN-β基因诱导裸鼠胶质瘤Fas 表达上调及细胞凋亡的实验研究

 目的 研究β干扰素基因对人脑胶质瘤的诱导凋亡作用,以及能否诱导胶质瘤细胞Fas表达上调,并探讨了β干扰素基因诱导细胞凋亡及Fas表达上调之间的联系. 方法 建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将IFN-β基因的真核表达载体pSV2IFNβ注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、TUNEL染色,了解IFN-β基因诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用以及胶质瘤细胞Fas表达情况. 结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡,胶质瘤细胞Fas表达明显高于对照组. 结论 IFN-β基因能够抑制人脑胶质瘤生长,并诱导胶质瘤细胞凋亡;IFN-β基因诱导胶质瘤细胞凋亡可能是Fas表达上调的结果.     

IMP3和Ki-67在人脑胶质瘤中的表达及其相关性

目的:探讨胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白3（insulin-like growth factor-Ⅱ mRNA-binding protein 3,IMP3）和Ki-67在脑胶质瘤组织中的表达及意义。方法:收集神经外科手术切除后经病理证实的胶质瘤标本126例,另收集脑外伤行内减压术患者的正常脑组织20例作为对照组,采用免疫组化SP法检测IMP3、Ki-67在不同级别胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平;应用Spearman秩相关分析IMP3和Ki-67在胶质瘤组织中表达水平的相关性。结果:IMP3、Ki-67在胶质瘤组织中阳性率为53.17%、56.35%;IMP3、Ki-67在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中阳性率均高于Ⅱ级(P＜0.05)。免疫组化半定量评分结果显示:正常脑组织和Ⅰ级胶质瘤中IMP3、Ki-67均为阴性表达;Ⅱ级胶质瘤中IMP3、Ki-67阳性表达多为弱阳性;Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中IMP3、Ki-67多数表达为弱阳性、中度阳性和强阳性;Ⅲ 级与Ⅱ级、Ⅳ级与Ⅱ级胶质瘤中IMP3、Ki-67阳性表达率比较,差异有统计学意义(P＜0.05);IMP3、Ki-67阳性表达均与胶质瘤的病变程度密切相关(P＜0.05)。胶质瘤组织中IMP3、Ki-67阳性表达率在不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置和病理类型之间差异均无统计学意义(P＞0.05);IMP3和Ki-67在胶质瘤组织中阳性表达率呈正相关(P＜0.05)。结论:IMP3、Ki-67分别可以有效地反映胶质瘤的病变程度,两者联合诊断可以客观反映胶质瘤病变程度,两者联合检测可能成为胶质瘤生物标记的新指标。     

结肠癌组织中Foxp3和TGF-β1的相互关系

目的：对结肠癌组织中Foxp3、TGF-β1蛋白进行检测,结合临床病理资料,分析其表达与患者临床病理资料及预后的关系。方法：收集56例结肠癌、癌旁组织标本和15例健康对照组的标本。应用免疫组化法检测56例结肠癌原发灶及癌旁组织和15例健康对照组织中Foxp3、TGF-β1蛋白的表达。结果：结肠癌患者组织Foxp3、TGF-β1阳性表达率均显著高于健康对照组和癌旁对照组（ P〈0.01）。癌旁对照组Foxp3、TGF-β1阳性表达率高于健康对照组,有统计学意义（ P〈0.05）。阳性表达率与淋巴结转移、临床Duke分期有关（P〈0.05）,与组织学分级、肿瘤大小无关（P〉0.05）。Spearman等级相关分析表明,结肠癌组织Foxp3与TGF-β1蛋白表达呈正相关。结论：Foxp3、TGF-β1在结肠癌组织中表达增高,提示在结肠癌患者中,全身免疫状态与肿瘤的生长和侵袭密切相关,Foxp3、TGF-β1可作为判断患者预后的指标,并为结肠癌的靶向治疗提供新的途径。     

黏附分子αvβ3和αvβ5介导肿瘤细胞与肿瘤内皮细胞的黏附

目的 体外分析黏附分子αvβ3和αvβ5及其配体Del-1、L1在肿瘤细胞-内皮细胞黏附中的作用.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞分析比较正常肝窦内皮细胞(LSEC)和肝癌的血管内皮细胞T3A上细胞间黏附分子1(ICAM-1)、αvβ3和αvβ5的表达以及缺氧对其表达的调控.分别用RT-PCR和Western blot方法分析6种肿瘤细胞Del-1和L1的表达及缺氧对其表达的调控.使用连续光谱荧光测定仪定量肿瘤细胞在LSEC和T3A上的黏附,并分析抗不同黏附分子的抗体和siRNA对肿瘤细胞一内皮细胞黏附的阻断作用.结果 T3A细胞αvβ3和αvβ5的基础表达高于LSEC,而ICAM-1的基础表达低于LSEC.缺氧上调两种内皮细胞αvβ3和αvβ5的表达,而ICAM-1表达仅在LSEC中升高.在不同肿瘤细胞中,Del-1和L1的基础表达存在明显差异,并且在缺氧条件下受到明显不同的调节.Del-1和L1高表达的肿瘤细胞在T3A细胞的黏附明显高于LSEC,并且在缺氧条件下黏附明显增加,这种黏附可以被抗αvβ3、αvβ5的抗体或沉默β3和β5的小干扰RNA(siRNA)阻断.结论 细胞黏附分子αvβ3、αvβ5及其配体在肿瘤细胞-肿瘤内皮细胞的黏附过程中起重要介导作用.     

STAT3信号转导通路抑制剂诱导胶质瘤干细胞产生自噬的研究

背景与目的:胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)在胶质瘤发展及治疗抗拒中发挥重要作用。我们以往的研究表明,新型STAT3信号转导通路抑制剂(STAT3 inhibitor,STI)WP1193能够诱导GSC产生细胞周期阻滞及凋亡。本研究旨在探讨STI是否能在体外诱导GSC产生自噬现象。方法:从手术切除的胶质母细胞瘤中分离及培养GSC。使用STI处理GSC。利用细胞计数法检测STI对GSC增殖的影响。使用Western blot检测自噬相关蛋白LC3的表达情况。吖啶橙染色后,利用荧光显微镜及流式细胞技术检测酸性自噬小体。使用透射电镜检测GSC中自噬小体。结果:STI剂量依赖性的抑制GSC的增殖。STI处理后,GSC中出现LC3表达的切换。STI处理后,GSC中出现自噬小体,且出现自噬小体细胞的比例增加。结论:STI能够在GSC中诱导自噬现象的产生。自噬在STI治疗中的意义及调节机制需要进一步的研究。     

Galectin-3调控Wnt信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的:半乳糖凝集素-3（Galectin-3）调控Wnt信号通路对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:RT-PCR及Western blot检测人脑胶质瘤组织中Galectin-3的mRNA和蛋白表达;Western blot检测人脑胶质瘤U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3的蛋白表达;将Galectin-3的特异性siRNA(Galectin-siRNA)转染人脑胶质瘤U87细胞,Western blot、流式细胞术分别检测转染48 h后Galectin-3、Wnt5a、β-catenin和Cleaved caspase3蛋白表达及细胞凋亡率。结果:Galectin-3在人脑胶质瘤组织mRNA和蛋白表达均显著高于瘤旁组织（P＜0.01）;U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3蛋白表达从高到低为U87>U251>SHG-44,选择U87细胞作为后续研究;Galectin-3-siRNA1的Galectin-3蛋白表达最低,选择作为后续研究;NC-siRNA组细胞凋亡率、Cleaved caspase3、Wnt5a、β-catenin蛋白表达与对照组差异不显著（P＞0.05）,与对照组比较,Galectin-3-siRNA组细胞凋亡率明显升高,Cleaved caspase3蛋白表达明显升高,Wnt5a和β-catenin蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结论:沉默Galectin-3表达可诱导人脑胶质瘤细胞凋亡,机制可能与Wnt信号通路的下调有关。     

miR-640通过抑制SLIT1介导Wnt/β-catenin通路促进脑胶质瘤对替莫唑胺的耐药

摘 要：［目的］评价miR-640介导Wnt/β-catenin通路对脑胶质瘤耐药细胞增殖、侵袭及替莫唑胺(temazolamide,TMZ)敏感性的影响。［方法］ 利用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定脑胶质瘤细胞内miR-640的表达。U87/TMZ细胞分为NC inhibitor组、 miR-640 inhibitor组和miR-640 inhibitor+si-SLIT1组。用不同浓度（15、30、60、120、240 、480和960 μmol/L）TMZ处理细胞,检测细胞对TMZ的耐药性;运用细胞计数试剂盒8（CCK-8）、Transwell实验检测U87/TMZ细胞增殖活力和侵袭力;用双荧光素酶报告基因实验验证miR-640与SLIT1的靶向关系。采用Western blot检测Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白表达水平。［结果］ miR-640在脑胶质瘤细胞中高表达,转染后miR-640 inhibitor组的miR-640表达水平、侵袭细胞数目（57±23 vs 153±31）、IC50值（131.61±8.97 vs 293.33±11.28）、增殖率（18.48±4.23 vs 43.84±8.94）均比NC inhibitor组低（P<0.05）。miR-640靶向调控SLIT1的表达,miR-640 inhibitor+si-SLIT1组β-catenin、c-myc、Cyclin D1蛋白表达水平均高于miR-640 inhibitor组（P<0.05）。［结论］miR-640通过SLIT1介导Wnt/β-catenin通路促进脑胶质瘤增殖、侵袭及对替莫唑胺的耐药性。