构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。 目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。 方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。 结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24 h比48 h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

大鼠CD80基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠CD80基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠NRK和IEC6细胞上鉴定其沉默效率.方法:将筛选获得的大鼠CD80基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与pGCSIL-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠NRK细胞、IEC6细胞和大鼠DC细胞(树突状细胞,Dentritic cell),分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到4×10~8 TU/ml.shRNA慢病毒颗粒感染NRK和IEC6细胞后CD80基因的 mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了66.9%和63.5%.结论:成功构建了大鼠CD80基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因.     

mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTORshRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础.方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞.通过GFP表达水平测定病毒滴度.结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+ 08 TU/ml.结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体.     

大鼠心肌素慢病毒RNA干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞分化的影响

目的: 构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰(RNAi)重组质粒,分析该RNAi质粒的干扰效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法: 设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段,退火后将双链oligo-DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCSIL- GFP获得重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd。以pEGFP-N1 / X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP-N1- Myocd。将重组干扰质粒和过表达质粒共转染293T细胞,Western blotting分析Flag标签蛋白的表达,筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs,RT-PCR和Western blotting检测myocardin及分化标志物SM22α的表达。结果: 成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd和过表达质粒pEGFP-N1-Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后,1号干扰质粒转染组Flag标签蛋白表达下降最显著。将1号质粒进行大包装,获得滴度为1×10¹² TU/L的慢病毒颗粒,该病毒转染VSMCs后,myocardin表达明显下调并伴随分化标志物SM22α表达的显著下降。结论: 成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd;抑制基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降,提示myocardin在VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL- GFP-shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制奠定了基础。     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

人Hes1-shRNA,Hes5-shRNA慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的 构建人Hes1-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,为Notch-Hes信号通路的相关研究奠定基础.方法 根据人Hes1,Hes5基因mRNA序列分别设计、合成多对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至pENTR /U6入门载体.通过入门载体瞬时转染神经胶质瘤U251细胞筛选有效干扰序列.将含有效干扰序列的入门载体与pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体进行LR重组构建Hes1-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒.用该慢病毒感染U251细胞,Western印迹法分别检测Hes1,Hes5蛋白的表达.结果 分别构建了针对Hes1和Hes5基因的特异性shRNA慢病毒表达载体,其包装获得慢病毒可有效感染U251细胞并分别对Hes1,Hes5蛋白的表达有显著抑制作用.结论 成功构建了Hes1-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。 目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。 方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。 结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×10⁶ U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为10⁶ TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因。通过HpaⅠ/XhoⅠ双酶切及其后的连接将其插入Lentilox3.7（pLL-3.7）质粒中。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Hsa-mir-196b的表达变化。结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒。所得慢病毒上清滴度为（7.2±1.1）×107TU/ml。感染慢病毒的239FT细胞中,Hsa-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍。结论成功构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体。     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达*

背景：已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。 目的：构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR 3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。 方法：采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165 mRNA及蛋白的表达。 结果与结论：成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×     107 VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165 mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR 3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165 mRNA及蛋白。 关键词：人血管内皮生长因子165;慢病毒载体;BLR 3A大鼠肝细胞;转染;基因治疗 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.007     

PTN shRNA腺病毒载体的构建及其对大鼠DRGn神经突起的影响

目的：构建特异性shRNA腺病毒载体，使之干扰神经轴突过度生长因子（PTN）在胰腺癌细胞中的表达，探讨其对SD大鼠背根神经节神经元（DRGn）神经轴突的影响。方法：设计并合成4对靶向PTN单链寡核苷酸（ss oligo），经变性退火为双链寡核苷酸（ds oligo）插入穿梭质粒pENTR／U6载体，测序正确后经脂质体介导转染胰腺癌细胞，通过RT-PCR方法筛选对PTN沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR／U6shRNA，然后与腺病毒骨架质粒进行同源重组，筛选出正确重组子，用HEK293A细胞包装出表达shRNA-PTN的重组腺病毒并测定其病毒滴度，通过Western blot方法对腺病毒沉默PTN效果予以检测。shRNA-PTN腺病毒构建成功后感染胰腺癌PC-2细胞，然后和DRGn共培养，观察DRGn生长分化和形态特征。结果：测序结果提示所构建的pENTR／U6-shRNA质粒正确，并从4对ds oligos筛选出对PTN沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR／U6-shRNA，经同源重组后成功构建了介导shRNA-PTN复制缺陷型重组腺病毒。转染胰腺癌细胞后，Western blot检测显示shRNA-PTN腺病毒感染胰腺癌细胞后对PTN蛋白的沉默效果7d后达最佳效果。感染shRNA—PTN腺病毒的胰腺癌PC-2细胞和DRGn共培养，DRGn神经轴突的生长和延长受抑制，以第7天最为明显。结论：成功地构建介导shRNA—PTN复制缺陷型重组腺病毒；感染shRNA—PTN腺病毒的胰腺癌PC-2细胞和SD鼠DRGn共培养可以抑制DRGn神经轴突的生长。     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。