X线联合胞嘧啶脱氨酶基因对结肠直肠肿瘤细胞的杀伤作用

目的 提高基因疗法对结肠直肠肿瘤的疗效。方法 以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,观察在X线作用下GFP基因对结肠直肠肿瘤细胞的转染效率及表达时间;用克隆形成试验观察X线对胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染的影响;同时用细胞存活率测定试验检测X线联合CD和5－氟胞嘧啶对结肠直肠肿瘤细胞的杀伤作用。结果 X线提高超螺旋质粒对结肠直肠肿瘤细胞的转染效率2－4倍,可提高线性质粒转染效率30倍。肿瘤细胞的存活率：转染CD基因组LoVo细胞为85％,8348细胞为88％;剂量X线联合空载体组为10％;LD90剂量X线联合CD基因组,LoVo细胞为9％,8348细胞为11％,加上X线作用,细胞总体存活率仅为1％。结论 X线联合自杀基因可有效地杀伤结肠直肠癌肿瘤细胞,可成为治疗结肠直肠肿瘤的一种全新有效的方法。     

腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞的杀伤作用。方法采用RT PCR技术从健康人的外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的Fas全长基因 ,与 pGEM TEasy质粒连接 ,经测序验证。构建 pcDNA3 1 Fas真核表达载体 ,将人Fas基因通过脂质体导入直肠癌 8348细胞中 ,并利用RT PCR方法检测直肠癌 8348细胞的Fas基因mRNA表达。用MTT法分析顺铂对转染前后直肠癌细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用。结果Fas基因转染可明显增强直肠癌 8348细胞的Fas表达 ,分别用 1、5、10、2 0、4 0mg/L浓度的顺铂作用 ,转染Fas基因的 8348细胞实验组细胞抑制率分别为 4 7 2 %、5 1 8%、5 7 2 %、6 5 4 %、71 0 % ;未转染Fas基因的 8348细胞对照组细胞抑制率分别为 2 9 6 %、33 0 %、37 8%、4 1 4 %、4 7 0 % ,2组相比 ,差异有显著性意义 (t =15 33,P <0 0 1)。结论转染的Fas基因可显著上调直肠癌 8348细胞的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞有更强的杀伤作用。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对胆囊癌细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因的应用对胆囊癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染人PA317细胞，用其病毒上清转染胆囊癌细胞GBC-SD，G418筛选出阳性细胞(GBC-SD/CD tk，应用不同浓度的5-FC或(和)GCV，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的GBC-SD/CD tk和GBC-SD细胞混合，联合应用5FC和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5FC或GCV均能对转染阳性的GBC-SD／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用，其旁观者效应明显。     

联合应用胸苷激酶基因和胞嘧啶脱氨酶基因对MCF-7细胞的杀伤作用

目的研究双自杀基因(胞嘧啶脱氨酶基因CD和胸苷激酶基因HSV-tk)的应用对乳腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法脂质体法将CD和HSV-tk双自杀基因转染入PA317细胞，用其病毒上清转染乳腺癌细胞MCF-7，G418筛选出阳性细胞MCF-7／CD tk，然后加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Fc)或／和丙氧鸟苷(GCV)，MTT法观察其杀伤作用；将不同比例的MCF-7／CD tk和MCF-7细胞混合，联合应用5-Fc和GCV杀伤，观察其旁观者效应。结果单独应用5-Fc或GCV均能对MCF一7／CD tk细胞产生明显的杀伤效应，联合应用可以在较小的剂量下产生更大的杀伤作用；当阳性细胞比例达到20％时即可对半数混合细胞产生杀伤作用。结论双自杀基因的应用对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用．其旁观者效应明显。     

胞嘧啶脱氨酶对表达不同水平癌胚抗原的大肠癌细胞株的杀伤作用

目的:探讨特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase,CD)/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)系统对表达不同水平癌胚抗原(CEA)的大肠癌细胞株的选择性杀伤作用。方法:用脂质体法将逆转录病毒载体G1CEACDNa和pCD2分别转导入大肠癌LoVo和SW480细胞株。将转染成功pCD2、G1CEACDNa及未转基因之LoVo和SW480细胞分别接种到BALB/c裸鼠皮下。成瘤2周后,每天腹腔注射500mg/kg的5-FC,观察治疗效果。治疗21d后处死动物,肿瘤标本称重后,以RT-PCR法检测目的基因在肿瘤组织中的表达;显微镜下观察肿瘤病理学变化。结果:目的基因在肿瘤组织中获稳定表达。治疗21d后,在LoVo细胞肿瘤中,G1CEACDNa阳性组和pCD2阳性组肿瘤分别重(60.8±15.3)mg和(410.5±56.3)mg,与未转基因组[(3018.5±453.5)mg]比较均有明显差异(p<0.01,t=4.512; P<0.01,t=3.320);G1CEACDNa阳性组与pCD2阳性组比较,亦有显著差异(P<0.05,t=2.375)。在SW480肿瘤细胞中,G1CEACDNa阳性组和pCD2基因阳性组肿瘤分别重(356.5±23.5)mg和(463.5±56.9)mg,与对照组[(3263.5±450.6)mg]比较有显著差异(P<0.01,t=4.547;P<0.01,t=4.475),但G1CEACDNa阳性组与pCD2基因阳性组之间无明显差异(P>0.05)。结论:组织特异性CD/5-FC系统对大肠癌细胞LoVo和SW480均有明显的选择性     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染和CD/5-FC对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用重组腺病毒介导外源CD基因转移到人直肠癌细胞株HR-8348,通过检测腺病毒的转导效率,CD基因表达,以及集落形成实验,细胞存活率测定,裸鼠移植癌治疗实验,观察分析CD/5-FC对癌细胞的杀伤作用,结果 重组腺病毒介导CD基因转染,在癌细胞中得到高效表达。CD/5-FC系统对转染含CD重组腺病毒HR-8348细胞的集落形成,细胞生长均有明显的抑制作用,而对无CD基因转染癌细胞无影响,在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,CD/5-FC除了杀伤转染CD基因的癌细胞外,对周围的无CD转染癌细胞也有明显的杀伤作用。表现出很强的“旁观者效应”。裸鼠皮下移植癌治疗实验结果表明,CD/5-FC对HR-8348实体癌生长抑制率为71.5%。结论 CD/5-FC对腺病毒介导CD基因转染的直肠癌细胞有很强的杀伤作用和显著的“旁观者效应”。     

胞嘧啶脱氨酶基因对胃癌细胞的杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶基因对胃癌细胞的杀伤作用。方法应用胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因,通过逆转录病毒载体转入人胃癌细胞Ｍ８５中,经０．４ｍｇ／ｍｌ的Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后进行前药５ＦＣ敏感试验。结果转ＣＤ自杀基因的Ｍ８５细胞较亲代Ｍ８５细胞对前药的敏感性显著增高（Ｐ＜０．０５）。体外实验中还观察到,前药在对转自杀基因的Ｍ８５细胞产生杀伤作用同时,还对与其共培养的亲代Ｍ８５细胞产生明显的杀伤作用,即“旁观者效应”。进一步将转基因Ｍ８５细胞和未转基因Ｍ８５细胞接种至裸鼠皮下,发现两者成瘤性无明显差异;前药５ＦＣ对未转基因肿瘤的生长无影响,而对转基因肿瘤的生长明显抑制。结论本研究为ＣＤ基因治疗胃癌向临床过渡提供了依据。     

FasL cDNA转染对直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨FasLcDNA转染和表达对直肠癌细胞耐药性的影响。方法:用RT-PCR方法克隆人FasL全长cDNA,构建pcDNA3.1-FasL真核表达载体,用脂质体法转染HR-8348人直肠癌细胞,采用MTT法检测顺铂对转染和未转染直肠癌细胞的生长抑制率。结果:DNA测序证实克隆FasLcDNA898bp与GeneBank序列完全一致。构建真核表达载体转染HR-8348细胞后,FasLmRNA表达明显增强。在不同浓度顺铂(1、5、10、20、40mg/L)的作用下,FasL转染组直肠癌细胞抑制率分别为11.0%、25.4%、31.2%、37.8%、42.4%:对照组癌细胞抑制率分别为26.1%、34.4%、37.6%、42.9%、53.2%,其差异有显著性意义(t=4.43,P<0.05)。结论:FasL转染HR-8348细胞可增强癌细胞的耐药性,减弱顺铂对HR-8348细胞的杀伤作用。     

重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶氨酶（ＣＤ）基因和人野生型ｐ５３基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３基因腺病毒感染直肠癌细胞ＳＷ８３７,计数瘤细胞集落数,采用四唑蓝比色（ＭＴＴ法）检测瘤细胞存活率。于６０只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）,测定肿瘤生长抑制率。结果 用ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３重组腺病毒感染ＳＷ８３７细胞,加５－ＦＣ后细胞集落形成分别为：６、３８、６９。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为７８．６％、５６．５％、２２．３％。ＣＤ／ｐ５３重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降最显著（Ｐ〈０．０１）,对肿瘤的抑制作用明显。结论 ＣＤ自杀基因与野生型ｐ５３基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对恶性脑胶质瘤荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用

目的 评判胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对恶性脑胶质瘤的抗肿瘤效果.方法 采用Lipofectamine2000TM脂质体介导方法将CD基因转染17251恶性胶质瘤细胞系,并接种于裸鼠前臂皮下,成瘤后腹腔注射5-FC(每13500mg/kg体重)10 d,观察荷瘤鼠肿瘤的生长情况,8周后比较转染组与对照组肿瘤的体积与重量,并进行病理形态学分析.结果 U251细胞获得CD基因的成功转染,5-FC用于不同组别荷瘤裸鼠,8周后转染组肿瘤体积(0.09±0.03)cm3和重量(0.28±0.11)g明显小于对照组(1.81±0.77)cm3和(1.63±0.80)g;形态学揭示转染组肿瘤细胞出现明显的凋亡与坏死.结论 裸鼠在体实验研究表明:CD/5-FC自杀基因治疗系统是治疗恶性脑胶质瘤行之有效的手段之一.     

热化疗对结肠癌LOVO细胞胞嘧啶脱氨酶基因表达的影响

目的 探讨温热疗法对转染胞嘧啶脱氨酶基因的基因表达的影响.方法 脂质体法将质粒G1CEACDNa转染结肠癌LOVO细胞,G418筛选抗体克隆并扩增,给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)进行热化疗;以β-actin为内参照用实时荧光定量PCR检测热化疗前后CD基因表达量的变化.结果 实时荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)检测得到热化疗前CD基因表达的CT值29.5300±1.1974,B.actinct值20.8200±2.7385;热化疗后CD基因表达的CT值30.285±1.201,β-actinet值21.225±2.237;行ΔΔCt法进行相对定量比较差异无统计学意义(P＞0.05,t=1.4521,v=38).结论 温热疗法对转染G1CEACDNa的LOVO细胞CD基因的表达无明显影响.     

腺病毒介导HSV-TK/CD基因对胆管癌体内体外的杀伤作用

目的　研究HSV TK /CD融合基因对胆管癌的杀伤作用。方法　腺病毒介导HSV TK /CD融合基因体外转染胆管癌细胞QBC93 9,与单自杀基因对照 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT )比色法测定肿瘤细胞生长抑制率 ,旁观者效应 ;构建胆管癌裸鼠模型 ,瘤内注射重组腺病毒 ,观察肿瘤生长情况。结果　与单一自杀基因转染组对照 ,双基因组表现出更强的抗肿瘤作用。当给予相同浓度的前体药物时 ,融合基因组 ,CD组和TK组的肿瘤细胞存活率分别为 3 .1%、3 2 .1%、5 5 .2 %。体内实验显示 ,融合基因组的肿瘤生长受到明显抑制 ,抑制率达 70 .7%。单自杀基因TK、CD组则分别为 41.2 %和 5 5 .7% ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。组织学检查可见实验组肿瘤发生明显坏死 ,这种现象在融合基因治疗组尤为明显。结论　与单自杀基因相比 ,HSV TK/CD融合基因在体内和体外都具有更强的抗肿瘤活性。     

CD/5-FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨

目的　探讨自杀基因系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成的抑制作用。方法　构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)基因的腺病毒穿梭载体 pAdTrack CMV CD ,与骨架载体pAdEasy 1在细菌内重组为 pAd CD ,经 2 93细胞包装、扩增 ,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的CD腺病毒液 ,建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型 ,观察CD基因的原位治疗及微血管形成抑制情况。结果　含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确 ,包装纯化后 ,检测病毒滴度为 2× 10 11pfu/ml,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌移植瘤的微血管形成具有较明显的抑制效应。结论　腺病毒介导CD/ 5 FC自杀基因系统 ,不仅可以直接杀灭癌细胞 ,而且还可通过抑制移植瘤微血管的形成来抑制胰腺癌细胞的生长 ,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法。     

联合胞嘧啶脱胺酶与尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因治疗小鼠胃癌

目的探讨联合应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因对胞嘧啶脱胺酶(CD)/氟胞嘧啶(5-FC)前药转换酶系统抗瘤作用的增强效应。方法将携带UPRT基因和CD基因的逆转录病毒载体通过PA317细胞包装成完整的病毒颗粒并浓缩和纯化。建立615小鼠胃癌皮下移植瘤模型,瘤内反复多次注射携带UPRT和CD基因的逆转录病毒,同时腹腔内给予5-FC,观察抑瘤效果。结果逆转录病毒介导CD基因瘤内原位转导,同时联合应用5-FC进行治疗,结果发现,在肿瘤接种后第12天,对照组肿瘤体积为(2.367±0.371)cm3,而CD/5-FC治疗组肿瘤体积大小为(0.704±0.358)cm3,肿瘤生长明显受抑(P<0.0005)。联合转导UPRT基因后,于肿瘤接种后第16天,肿瘤体积为(0.731±0.255)cm3,而单独应用CD基因治疗组肿瘤体积为(1.455±0.370)cm3,从而证实联合转导UPRT基因可进一步增强CD/5-FC自杀基因系统的抑瘤作用(P<0.001)。结论联合转导UPRT基因,可显著增强CD/5-FC自杀基因系统的抗瘤效应。