新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的建立一种简便的新生大鼠皮层神经元的体外原代培养方法。方法取新生24 h内的大鼠,分离大脑皮层,消化后接种于L-多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶内,以含胎牛血清的DMEM高糖培养基为种植液,24 h后换用含有B27的Neurobasal的无血清培养基维持,倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光染色法鉴定皮层神经元纯度。结果接种后2 h,皮层神经元开始贴壁;随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞长出突起,神经元突起间逐渐开始交织成网。接种后7 d神经元胞体丰满,突起明显延长,相互间形成了明显的神经网络。经NSE免疫荧光技术鉴定神经元纯度为(93.57±3.9)%。结论该方法简单易行,可获得高纯度的大鼠皮层神经元。     

一种大鼠海马神经元的原代培养方法

目的 建立一种简便高效的海马神经元的原代培养方法.方法 无菌环境下取新生SD大鼠(24 h内)海马,清洗、剪碎,以0.25%胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,混合培养,约5 d后加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长.采用免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况,观察海马神经元形态.结果 海马神经元纯度≥90%.神经元接种3 d后具有典型的形态特征,13～14 d突起形成密集的神经纤维网络,14 d后细胞出现凋亡.结论 本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础.     

一种简单高效的新生鼠海马神经元原代培养方法

【目的】建立一种简单、高效、高纯度的新生小鼠海马神经元的原代培养方法。【方法】取出生24 h内的C57BL/6J新生鼠,分离海马组织,采用胰蛋白酶消化加机械吹打的方法获得单个细胞,用含体积分数1%B27及2%Glutamax-100X、终浓度25μmol/L Glutamate的Neurobasal-A培养基接种培养,3 d后用去Glutamate成分的上述培养基换液,并加阿糖胞苷作用48 h以抑制胶质细胞增长。于倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态,采用微管蛋白相关标志物2(MAP2)及Hoechst33258免疫荧光染色鉴定神经元纯度。【结果】此培养方法获得的海马神经元生长状态良好,细胞形态从接种时的圆形透亮、无突起,到培养第7天后发展为神经元胞体聚集、树突发达并形成纵横交错的神经网络;经鉴定,神经元的纯度高达97.2%以上,且能稳定存活2~3周。【结论】该方法操作简单、高效,所得神经元纯度高,结果稳定。     

GFP转基因胚胎小鼠海马神经元培养方法的建立

目的建立一套稳定、成熟的绿色荧光蛋白（GFP）转基因胚胎小鼠海马神经元体外原代培养的方法，搜集培养神经元的形态资料，为今后的GFP转基因小鼠海马神经元培养后移植治疗神经系统等疾病提供重要的理论和实践依据．方法采用体外培养法对取材于GFP转基因小鼠海马的神经元进行培养，用其特异的抗体免疫组化鉴定后，分别于倒置相差光学显微镜及荧光显微镜下观察，培养细胞可存活1个月以上，5—7d左右细胞生长最好，神经突起多而粗大，分支互成网络，14d后生长减缓．结果建立了成功的海马神经元培养方法，经免疫组化证实为海马神经元，在培养后的不同阶段海马神经元生长良好．结论该培养方法成熟稳定。不失为培养GFP转基因小鼠的一种良好的方法，值得借鉴和推广．     

简易大鼠海马神经元原代培养方法及神经元兴奋性检测

目的 对原有大鼠海马神经元原代培养方法进行改进,在获得数量多、纯度高、体外生长时间长的神经细胞的同时,简化操作流程、节省时间、减少污染.方法 分离24h内出生的Wistar大鼠双侧海马,采用机械吹打法,以沉降法代替过滤制备单细胞悬液,细胞接种24h后培养液更换为添加B27的DMEM/F12无血清培养基,以后每周半量换液2～3次.用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物神经元特异烯醇化酶(NSE)鉴定神经细胞的纯度,并以钙影像仪测定KCl作用神经元后细胞的钙离子浓度变化,了解神经元的兴奋性.结果 此简易方法节约操作时间及科研成本,减少了污染的机会.所培养的神经元杂质少、纯度高、细胞活性好,体外存活时间长.结论 该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠海马神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型.     

SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察

目的：掌握SD大鼠海马神经元体外培养方法,观察神经元形态学特点,测定细胞生长曲线。方法：新生SD乳鼠,剥离海马,胰酶消化,接种,1 d换为Neurobasal培养基;小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶为一抗,免疫细胞化学法计数阳性细胞百分率并显微摄影;1%甲苯胺蓝、苏木精伊红染色。结果：原代培养神经元6~8 h内开始贴壁,培养5~7 d突起增粗增长,连接成网,以多极神经元为主,胞体呈三角形、梭形、椭圆形;MAP-2、NSE染色为棕褐色,经鉴定神经元纯度达90%左右;细胞经历生长潜伏期,对数生长期,平台期;细胞核大而圆,HE染色胞核深蓝色,胞浆红色,胞体中可见尼氏颗粒。结论：相差显微镜下神经元形态多样,MAP-2、NSE染色阳性细胞,HE染色细胞核呈深蓝色,胞浆为红色,尼氏体位于细胞质内,神经突起内少见。     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

一种简单的原代神经元培养及转染方法

目的 建立一种简单、高效、稳定的原代神经元培养及转染方法. 方法 无菌条件下分离生后2 d内SD大鼠海马,经消化、反复沉淀后获得海马组织细胞悬液,利用差速贴壁法对神经元进行纯化,采用神经元专用无血清培基进行培养,并于倒置显微镜下观察神经元形态的变化, 采用微管相关蛋白( MAP2 )抗体对细胞进行鉴定;利用慢病毒转染神经元,观察神经元转染效率. 结果 体外培养的原代神经元,在培养第10~15天可以形成密集的神经元网络,细胞健壮,神经元特征明显;经MAP2鉴定,神经元纯度达95%以上;利用慢病毒转染神经元,转染效率达95%以上. 结论 采用该方法进行原代神经元培养,能够获得高纯度的原代神经元;慢病毒是神经元转染的理想载体.     

吡咯喹啉醌对培养的鼠海马神经元的促生长作用

目的:探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对培养海马神经元的促生长作用。方法:原代培养新生大鼠海马神经元,观察PQQ对海马神经元胞体、突起生长和存活率的影响,测定MTT代谢率和脂褐素。结果:PQQ处理后,海马神经元突起的长度和胞体的长径显著大于对照组,细胞的存活率增加、存活的时间延长,尼氏小体的光密度值和MTT代谢率显著高于对照组,脂褐素的含量降低。结论:PQQ能促进海马神经元的生长,增加其存活率、延长存活时间。     

海马神经元原代培养与纯度鉴定方法的优化

目的:通过优化和改进传统的神经元培养方法,探讨一个简单、高纯度的大鼠胚胎海马神经元的原代培养及活性检测方法。方法:颈椎脱臼处死孕鼠,迅速取海马,剥离血管网等结缔组织后,消化并吹打制成细胞悬液,以适当的密度接种入DMEM/HG培养基,4h后换用Neurobasal培养基,以后每2-3d进行1/3量换液。倒置显微镜观察神经元的形态变化,并采用CCK-8试剂盒检测神经元活性和神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定神经元纯度。结果:细胞接种4h后贴壁,随着培养时间的延长神经元的形态发生一系列变化,从圆形、透亮、体积小逐渐变为椭圆形、三角形或椎形,有光晕,胞体增大,突起伸长且分支增多,在培养第4天后逐渐连接呈网络状。神经元纯度随时间的延长逐渐升高,培养第7天纯度高达90%以上。神经元在培养的第9、10天达到成熟,即可用于后续研究。结论:本实验方法简便易行,神经元纯度高、细胞活性好,体外存活时间长,是体外研究的良好实验模型,值得推广应用。