以Bio-oss胶原为支架材料的组织工程化骨修复种植体周围骨缺损的初步实验研究

目的研究以Bio-oss胶原为支架材料的组织工程化骨修复种植体周围骨缺损的效果。方法取4只小型猪设立自身对照,获取骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测,将培养的第3代细胞同Bio-oss胶原构建BMSCs/Bio-oss胶原复合物,构建小型猪下颌骨种植体周围骨缺损模型,将复合物植入骨缺损处,通过影像学、能谱分析种植体-新骨界面Ca2+含量及组织学检测初步评价其促成骨作用。结果Ⅰ型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性,Von Kossa染色可见钙结节形成;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;8周时成骨组织学观察可见BMSCs/Bio-oss胶原复合物植入组成骨量大于Bio-oss胶原植入组,能谱分析显示,2组Ca2+含量有统计学差异。16周时,组织学观察可见2组成骨量已无明显差别,能谱分析显示,2组Ca2+含量无统计学差异。结论利用BMSCs/Bio-oss胶原复合物修复小型猪种植体周围骨缺损相对于植入Bio-oss胶原能够缩短种植体发生骨结合的时间。     

收集骨修复种植体周围骨缺损的效果评价

目的:测量aspeo12000骨收集器在牙种植术中收集的骨量,观察收集骨的组织学特点、成骨活性及即刻移植修复种植体周围骨缺损的临床效果。方法:分2组进行。第1组,15例健康牙种植患者,应用aspeo12000骨收集器收集18颗ITI种植窝制备时钻出的骨屑,测量收集骨的体积,并用t检验比较不同性别、不同部位之间是否存在差别;每一样本脱钙后常规包埋、HE染色,光镜下观察其形态结构,计算骨组织面积所占的比例。第2组:11例患者,植入16颗种植体时发生12处骨缺损,所有缺损应用收集骨即刻移植或收集骨与Bio-oss混合移植。结果:健康牙种植患者收集骨量在不同性别、不同部位之间无显著差异,制备1个种植体窝平均可获得0.93倍体积的“湿骨”。光镜下收集骨以骨组织为主,其面积约占94.2%。牙种植术后3～6个月,原缺损处局部形态饱满,二期手术时见缺损处已覆盖成熟骨质,移植骨成活良好。结论:应用骨收集器获得的收集骨即刻移植修复种植体周围小的骨缺损,是一种简单实用的方法。     

多孔型活性CPC复合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:观察多孔型活性磷酸钙骨水泥用作骨组织工程支架材料的可行性.材料与方法:抽取成年毕格犬的骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞,经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况.将培养的第3代细胞接种于多孔型活性磷酸钙骨水泥,进行超微结构观察,并将多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物植入毕格犬背部皮下,2,4周后进行组织学检测.结果:碱性磷酸酶染色呈阳性;Von Kossa染色可见钙结节形成;骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示4周时复合物内有新骨形成.讨论:活性多孔CPC/BMSCs骨修复材料孔径250μm,孔隙率为70%,易于BMSCs的渗入发育成骨.结论:多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物显示良好的成骨活性,多孔型活性磷酸钙骨水泥可以用于骨组织工程支架材料.     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测

目的　探讨牙周膜成纤维细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法　采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞 ,以人胎儿皮肤成纤维细胞为对照检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。结果　体外培养人牙周膜成纤维细胞与人胎儿皮肤成纤维细胞相比表达更高水平的碱性磷酸酶 (P <0 .0 5 ) ,矿化诱导液连续培养 30d均可观察到矿化结节形成。结论　采用酶消化法可快速简便地获取原代人牙周膜成纤维细胞。体外培养牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征 ,与人胎儿皮肤成纤维细胞相比更具分化潜能 ,可作为牙周组织工程种子细胞来源     

活性胶原基纳米骨修复即刻种植体周围骨缺损的研究

目的:观察胶原基纳米骨(nHAC)及活性胶原基纳米骨(AnHAC)修复即刻钛种植体周围骨缺损的效果,为临床应用奠定理论依据。方法:犬下颌骨拔牙创区制造即刻种植体周围骨缺损,分别采用植入nHAC、AnHAC、自体牙槽松质骨及不植入任何材料4种不同方法修复种植体周骨缺损,术后6周、12周,采用X线摄片、骨密度测量及组织学检查,观察新骨形成情况和新骨与种植体的关系。结果:两组实验动物中,除空白对照组外,骨缺损区均愈合良好,未见种植体周围炎发生。1)nHAC组:术后6周已有新生骨小梁形成,术后12周修复骨缺损,种植体边缘可见较多新骨形成;2)AnHAC组:成骨过程较早,术后6周即有较多新生骨组织出现,术后12周新骨组织与宿主骨完全融合,并与种植体表面形成广泛的骨性结合。结论:nHAC具有良好的骨引导作用,可良好地修复种植体周骨缺损,复合rhBMP-2后效果更佳。临床上可根据具体情况选用修复即刻种植体周围骨缺损的方法。     

大鼠骨髓基质细胞促进自体骨形成的实验研究

目的研究自体骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外诱导扩增与仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料(nano chitosan sodium collagen scaffold,NCSCS)复合修复骨缺损的可行性。方法分离纯化Wistar大鼠BMSCs,诱导BM-SCs向成骨细胞(osteoblast,OB)转化,经碱性磷酸酶、茜素红组织化学染色鉴定,将BMSCs复合仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料(nano chitosan sodium collagen scaffold,NCSCS)进行扫描电镜观察。制作Wistar大鼠胫骨骨缺损模型,缺损处NCSCS-BMSCs复合物移植后观察骨缺损修复成骨情况。结果扫描电镜下BMSCs细胞在仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料上大面积生长。BMSCs复合仿生纳米壳聚糖-胶原复合支架材料植入2周后,材料周围可见大量纤维组织,并可见成骨细胞和少量新生的骨样基质,新生骨对照组和实验组比较差异显著(P<0.01);植入6周后,可见到材料与新生骨之间相互混杂,中有纤维相间隔,和原有骨界面尚清晰可辨认,材料部分降解,对照组和实验组比较新生骨有统计学差异(P<0.05);植入12周后,材料几乎降解完全,和天然骨组织界面可见新骨形成,对照组和实验组比较新骨形成无统计学差异(P>0.05)。材料降解在各时间段对照组和实验组比较差别不显著(P>0.05)。结论 BMSCs介导NCSCS修复骨缺损优于单纯的NCSCS修复骨缺损,尤以早期效果为好。     

种植体＋bFGF基因修饰骨髓基质细胞复合Bio-Oss胶原修复犬颌骨缺损的实验研究

目的:(1)观察经bFGF基因转染的犬骨髓基质细胞(BMSC)复合多孔矿化Bio-Oss胶原骨修复下颌骨极限骨缺损的效果.(2)观察骨融合种植体与骨髓来源的成骨细胞及多孔矿化Bio-Oss胶原支架复合体,植入体内后新骨的形成及与种植体的愈合情况.方法:用脂质体转染技术将bFGF基因转入犬BMSC,将转染和未转染细胞分别与Bio-Oss及凝胶复合.杂种犬8只,按植人物不同分为2组:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组;(2)种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组,修复犬下颌骨极限骨缺损.于术后24周取材,分别行大体、放射线、组织学观察骨缺损的修复情况.结果:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,基本上由新生骨组织所修复,但骨组织密度稍不均匀,种植体与周嗣骨组织基本上形成骨结合.(2)种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组:骨缺损区基本由新生成熟的骨组织所修复,骨小梁形成,与种植体骨结合良好.结论:Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效地修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料,并且种植体与组织工程骨能够形成良好的骨结合.     

兔髁突来源骨髓间充质干细胞体内对骨缺损修复的实验研究

目的:研究兔下颌骨髁突来源骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的体外分离、培养、鉴定及其体内成骨情况。方法:从兔下颌骨髁突中分离干细胞进行培养,对BMMSCs向成骨、成骨骼肌细胞的分化进行鉴定。实验组将BMMSCs复合于载黄芪多糖(APS)支架材料上,植入骨缺损区;对照组1植入单纯珊瑚羟基磷灰石(CHA)材料;对照组2植入APS/CHA复合材料;空白组不植入任何材料。应用组织学和扫描电镜观察,并比较植入材料与骨组织交界处的成骨修复情况。结果:细胞经过传代后形态一致,呈梭形;ALP染色呈阳性,成骨诱导后形成钙结节;成骨骼肌诱导后desmin免疫细胞化学染色阳性。植入体内修复骨缺损12周,实验组见大量新生骨及活跃的骨细胞;对照组1仅在材料表面见少量新骨形成;对照组2材料内有部分新骨形成;空白组基本未见骨修复。结论:从兔下颌骨髁突中分离、培养出的BMMSCs,具有体内、体外成骨的能力。     

牙种植手术中自体骨的收集和应用

目的：研究牙种植过程中，收集自体骨即刻移植修复种植体周围小型骨缺损的临床疗效。方法：2003年10月至2005年10月，选择14例牙种植患者，植入25颗种植体时发生17处骨缺损，其中开窗式骨缺损9处，烦（舌）侧种植体颈部暴露8处。在牙种植窝制备过程中，应用自制的集骨器收集随冷却水流出的骨屑，并将其即刻移植或与Bio—oss混合后移植修复骨缺损。结果：牙种植术后3-6个月，原缺损处局部形态饱满，X线片示种植体与周围牙槽骨形成良好的骨结合，二期手术时见缺损处巳覆盖成熟骨质，移植骨成活良好。结论：应用自制集骨器获得的收集骨修复种植体周围小型骨缺损，方法简单实用。     

Particulated bone grafts--effectiveness of bone cell supply

OBJECTIVE: The objective of this study was to measure the amount of viable bone cells present in different types of bone graft. MATERIAL AND METHODS: Bone chips were harvested from the trabecular or cortical bone of the mandible or the iliac crest and either milled or not. The average size of unmilled bone particles was 5 x 5 x 5 mm and that of milled was 2 x 2 x 2 mm. Drill sludge was obtained using either a ball reamer, a diamond ball or an implant drill (the latter from mandibular bone and of average dimension 1 x 1 x 1 mm). A measure of 0.5 g of each category was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium with additives for four weeks. Cell counts were performed. An analysis of the osteocalcin synthesis, the alkaline phosphatase (ALP) activity, the collagen types and the concentration of bone-specific collagen cross-links in medium supernatants was performed. RESULTS: Cells stained positively for osteocalcin and ALP in all groups. Bone-specific collagen cross-links could be quantified and collagen of types I and V was present with no difference in all groups. Unmilled spongy bone chips revealed greater cell counts than milled (P<0.05). Spongy bone chips revealed greater cell counts than cortical bone chips (P<0.05). Drill sludge obtained by hard alloy ball reamer showed the least amount of viable cells (P<0.05). CONCLUSIONS: Bone milling reduces the quantity of osteoblasts. Bone obtained by the ball reamer supplies a smaller number of cells than bone obtained by other methods. Unmilled spongy bone chips appear to offer the greatest amount of viable osteoblasts.     

低温保存成骨细胞复合生物活性玻璃陶瓷修复兔下颌骨缺损

目的 观察经低温保存的兔骨膜源性成骨细胞(POBs)的生物学特征,及其与生物活性玻璃陶瓷(BGC)体外复合后修复颌骨缺损的能力。方法 将经鉴定的幼兔骨膜源性成骨细胞置入液氮罐中保存,取冻存6个月的细胞做生物学鉴定,并进行体外培养扩增,然后与BGC复合培养,植入兔下颌骨缺损处,对照组为植入单纯BGC组。术后第2、4、8、12周取材,行X线摄片及组织学检查,观察复合材料的成骨能力。结果 复苏的成骨细胞仍具有典型的成熟成骨细胞的生物学特征,与BGC复合植入体内后,能继续生长增殖并形成骨组织,能较快较好地修复骨缺损。结论 利用冻存复苏的成骨细胞进行组织工程学研究是可行的,细胞与材料复合所形成的组织工程化骨,可望在骨组织的修复与重建中得到更加广泛的应用。     

牙髓干细胞修复即刻种植周围骨缺损

目的：建立兔下颌骨前牙区即刻种植种植体周围骨缺损的动物实验模型,并观察牙髓干细胞在种植体周围骨缺损中骨再生能力。方法：将实验兔分为2组,分别拔除兔双侧下颌前牙,并在拔牙窝颊侧建立2 mm ×3 mm大小骨缺损区,即刻植入种植体。对照组植入Bio-oss骨粉,实验组植入Bio-oss骨粉与牙髓干细胞（ Dental Pulp Stem Cells,DPSCs）,通过扫描电镜和HE染色观察评价植入后4周种植体-骨结合状况。结果：扫描电镜观察见实验组种植体周围骨缺损处可见编织骨及骨小梁形成,种植体与牙槽窝间隙基本消失且与龈方间隙减小,周围松质骨密度增高。实验组HE染色切片见种植体周围骨缺损处牙槽骨部分胞质呈空泡状,成骨细胞与破骨细胞分布于骨小梁上,骨小梁致密且排列规则。结论：建立的兔下颌骨前牙区即刻种植的种植体周围骨缺损动物实验模型,可为即刻种植方向的相关研究提供重要参考。     

可吸收胶原膜在即刻种植中引导骨组织再生作用的研究

目的:通过动物实验研究可吸收胶原膜在即刻种植骨缺损区引导骨组织再生的作用。方法:8只实验用犬,拔除双侧下颌第二、三、四前磨牙,每个拔牙窝植入1枚种植体,并在种植体颈部对应牙槽骨上制备半环状骨缺损,将每只实验犬口内的6处骨缺损随机分为3组,每组两处,并给予不同处理。A组:骨缺损中植入珊瑚羟基磷灰石,并用可吸收胶原膜覆盖;B组:骨缺损中单纯植入珊瑚羟基磷灰石;C组:骨缺损中不植入任何材料,作为空白对照组。3个月后处死所有实验动物,制作含单个种植体的骨标本,进行大体观察、生物力学测定、组织形态学观察及测定。结果:3组标本骨缺损区均可见新骨生成,A组种植体颈部骨缺损区无软组织长入,新生骨量多,骨质成熟,成骨效果最好;B组次之,部分标本骨缺损区有软组织长入,新生骨量及骨质均不如A组。C组最差。结论:可吸收胶原膜生物相容性良好,可降解,可阻止软组织向骨缺损区长入,对骨组织再生有促进作用。     

人骨髓间质干细胞的培养及成骨功能研究

目的　体外扩增人骨髓间质干细胞 (humanbonemarrow derivedmesonchymalstemcells,hBMMSCs) ,研究其生物学特征及体内、外成骨功能。方法　分离培养hBMMSCs,并对其形态、增殖动力学、碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase,ALP)表达及体内、外成骨功能进行研究。结果　hBMMSCs可在体外培养扩增 ,群体倍增时间约为 3 5d。ALP检测表明 ,未经矿化诱导的hBMMSCs可表达少量ALP ,诱导后其表达量明显增高。vonkossa染色证实在矿化诱导液作用下hBMMSCs在体外可形成钙结节。体内成骨实验证实 ,1× 10 5个hBMMSCs接种到 30mm3 块状HA/TCP载体移植BALB/C裸小鼠皮下 3个月 ,可观察到层板状骨组织生成。结论　hBMMSCs是一种具有成骨潜能的前体细胞 ,经培养、扩增、诱导后 ,在体外可形成矿化结节 ,体内可在载体表面形成骨组织。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。