当归ISSR-PCR反应体系的建立优化及引物筛选

目的建立并优化当归的ISSR-PCR反应体系,并进行引物筛选。方法以当归基因组DNA为模板,通过单因素实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Taq DNA聚合酶、d NTP、模板、引物)以及热循环参数(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间、循环数)对扩增结果的影响。结果找出了各自的最适条件,建立了适合当归ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在20μl反应体系中,内含10×Taq Buffer(含1.5 mmol·L-1Mg Cl2)、1.25U Taq DNA聚合酶、250μmol·L-1d NTP、40 ng模板、0.25μmol·L-1引物。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸150 s,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。结论以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出17条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。该研究为当归药材DNA鉴定、种质资源研究以及优良品种选育奠定了基础。     

粗茎秦艽ISSR-PCR反应体系的优化

目的:建立粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk的ISSR-PCR最佳反应体系。方法:基因组DNA为模板,分别对体系各因子进行考察。结果:最佳体系为:总体积10μL,其中含0.5-1.5ng/μL DNA模板,l0×Buffer缓冲液1μL,2.5mmol/L Mg2+,0.5UTaq DNA聚合酶,0.6μmol/L引物,0.2mmol/L dNTPs。反应程序:94℃预变性5min;之后,94℃变性30s,54℃复性45s,72℃延伸90s,共38个循环;循环结束后72℃延伸7min。结论:该体系可用于粗茎秦艽种下及种间遗传变异分析及药材道地性研究。     

基于方差分析优化菊花ISSR-PCR反应体系

目的 对影响药用菊花ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础.方法 基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg~(2+)、dNTP和引物等4因素3水平对药用菊花反应体系进行优化.结果 药用菊花ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.00 U,Mg~(2+)2.00 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,引物0.50μmol/L.结论 Taq酶、Mg~(2+)、dNTP等对ISSR反应结果有极显著影响.所建立的药用菊花ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究.     

麻花秦艽种子发芽特性的研究

用热水浸种、不同发芽温度及不同浓度的赤霉素等处理麻花秦艽种子,结果:种子发芽适温为20℃,用200 ppm赤霉素浸种24 h,发芽率可达90.0%.     

麻花秦艽开发利用探讨

采用高效液相色谱法(HPLC)测定甘肃栽培麻花秦艽不同部位、产地和采收期样品的龙胆苦苷含量。结果表明:3年生秦艽的龙胆苦苷含量稍高于2年生,但差异性不显著;根、茎和叶的平均龙胆苦苷含量依次为13.3%、2.95%和2.24%;同一生长年限随采收期延后,茎、叶中龙胆苦苷含量逐渐降低,而根中含量却逐渐上升;不同产地的根样品,依海拔由低到高的,陇西、康乐和临潭分别为10.23%、13.12%和15.54%。本探讨获初步结论:甘肃栽培的麻花秦艽茎和叶的龙胆苦苷均已达到药典的2%标准,宜加以开发利用;从龙胆苦苷产量及生产成本综合考虑,以种植两年较好,根的采收期宜在10月以后封冻前;而以茎叶为生产目标可在8月下旬至9月初采收为佳;高海拔区栽培秦艽有利于秦艽根中龙胆苦苷含量的积累。     

麻花秦艽染色体的核型分析

目的:首次对麻花秦艽的染色体数目、核型等进行分析研究,并与秦艽和小秦艽进行比较,为其遗传和进化提供了进一步的细胞学证据。方法:根尖用0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液预处理5.7h,用2.5%混合酶液,于25℃下酶解1.6h,低渗处理3h(置于冰箱内),然后采用空气干燥制片法,结合显微摄影对染色体进行分析。结果:麻花秦艽核型公式是K(2n)=26=2M+24m,核型不对称系数(AS.K)为52.68%,属于"1A"型。结论:麻花秦艽的核型与秦艽、小秦艽相比较,秦艽最为进化,麻花秦艽介于秦艽和小秦艽之间。     

濒危药用植物麻花秦艽和粗茎秦艽cpDNA提取研究

目的：对麻花秦艽和粗茎秦艽叶绿体基因组进行提取研究,为进一步研究秦艽叶绿体的基因组序列特征、遗传多样性以及资源保护研究奠定基础。方法：本文以麻花秦艽、粗茎秦艽为对象,采用改良的蔗糖密度梯度离心方法进行提取,优化纯化方法,分离得到秦艽叶绿体后测定cpDNA浓度,检测其OD值并扩增ITS2序列验证其纯度。结果：获得高质量、高纯度的cpDNA（0．1～0．4μg／10g）,扩增ITS2序列验证其无核污染,满足后续测序要求。结论：cpDNA的纯度和质量对叶绿体基因组测序的正确率和可信度具有重要的影响。本文获得了高纯度、高质量的秦艽cpDNA,为秦艽叶绿体基因组全序列的获得提供保障。     

麻花秦艽组织培养及植株再生的研究

目的：研究药用植物麻花秦艽组织培养技术,为工厂化育苗提供科学依据。方法：以麻花秦艽根、茎育出的无菌苗为外植体,采用MS培养基,附加不同的植物激素进行实验。结果：以MS培养基为基本培养基,附加BA 0.5～1.0 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1,适于丛生芽的诱导与增殖；附加IAA 1.0 mg·L^-1+BA 3 mg·L^-1,适于愈伤组织的诱导；附加IAA 1.0 mg·L^-1+BA 2.0～3.0 mg·L^-1适于愈伤组织继代培养,附加BA 2.0 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1适于愈伤组织的分化。结论：通过诱导愈伤组织途径可以达到快速繁殖的目的。     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

党参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的：建立党参的ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR标记技术进行党参鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法：采用试剂盒法提取党参基因组DNA为模板,通过单因素实验分析了ISSR-PCR反应体系中MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果：建立了重复性好,分辨率高的ISSR-PCR反应体系,即在25μL反应体系中,含有10×PCR Buffer缓冲液2.5 μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.5 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为30 ng;扩增程序为：94 ℃预变性5 min,然后94 ℃变性30 s,51.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共计35个循环,循环结束后在72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。结论：建立了适用于党参的ISSR-PCR反应体系,为应用ISSR技术鉴定党参种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

开口箭ISSR-PCR实验反应体系条件的优化

目的:建立与优化药用植物开口箭ISSR-PCR实验反应体系.方法:以开口箭DNA为材料,分析了Mg2+,dNTP,引物及Taq DNA聚合酶浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响.结果:确立了稳定的、可重复的开口箭ISSR最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含1 × buffer,2 U Taq DNA聚合酶,2 mmol·L-1 MgCl2,0.2 mmol·L-1 dNTP,0.75 μL引物.结论:从80条简单序列重复区间(ISSR)通用引物中筛选出了16条条带清晰稳定的引物,设置了不同的引物退火温度,为进一步进行开口箭的遗传多样性分析的研究奠定了基础.     

青天葵ISSR-PCR体系优化及引物筛选

目的:建立适合青天葵遗传差异分析的简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链式(PCR)反应体系。方法:采用正交试验设计对影响青天葵ISSR-PCR反应体系的5种因素(dNTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶)4个水平进行优化,并结合新复极差法,对试验中各单因素进行分析。结果:确立了青天葵最佳反应体系,即在20μL的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μL,dNTP 225μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA60 ng;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的青天葵ISSR-PCR反应体系,经过24份青天葵样品检验,得出该体系稳定可靠,可用于青天葵遗传差异分析。     

西藏麻花艽种质资源的遗传多样性分析

目的 对西藏不同产地17份麻花艽Gentiana straminea样品的遗传多样性进行比较分析。方法 居群采样,以相同产地同属近缘种粗茎秦艽G. crassicaulis为外类群比对,nrDNA ITS区序列分析,构建UPGMA系统树。结果 西藏产麻花艽nrDNA ITS区序列有1个多态性位点;外类群粗茎秦艽6份样品序列完全一致。结论 麻花艽与外类群种间区别明显;17份不同产地麻花艽被划分为2类,遗传多样性较为丰富,为西藏麻花艽药材品质评价及麻花艽核心种质的构建提供基础资料。     

不同产地麻花秦艽中5种环烯醚萜苷成分的含量比较

目的: 建立HPLC同时测定麻花秦艽中马钱苷酸、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、山栀苷甲酯含量的方法。方法: 采用Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm),流动相乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,柱温30 ℃, 检测波长240 nm。结果: 以上5种环烯醚萜类成分的线性范围分别为0.042 1~8.420 0(r=0.999 7),0.094 2~18.830 0(r=1.000 0),0.012 4~2.471 2(r=0.999 9),0.009 9~1.971 2(r=1.000 0),0.011 3~2.260 0 μg (r=0.999 0),平均回收率均在95.39%~103.75%,RSD≤2.6%。结论: 该法简便、快速、准确,可以用来同时测定麻花秦艽中5种环烯醚萜苷成分的含量。     

黄脉九节的化学成分研究

综合运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、ODS反相柱色谱及制备型高效液相等色谱分离技术,对茜草科九节属植物黄脉九节Psychotria straminea枝叶的化学成分进行系统的分离和纯化。根据化合物的理化性质和波谱数据,并通过与文献对照,鉴定了从黄脉九节枝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取部位中分离得到的16个化合物,包括8个黄酮类化合物、3个香豆素类化合物和5个三萜类化合物,分别鉴定为杨芽黄素(1)、芹菜素(2)、山柰酚(3)、木犀草素(4)、香叶木素(5)、槲皮素(6)、山柰酚-4''-O-甲醚(7)、鼠李素(8)、7-羟基香豆素(9)、7-甲氧基香豆素(10)、东莨菪内酯(11)、羽扇豆醇(12)、30-醛基羽扇豆醇(13)、羽扇豆醇乙酸酯(14)、α-香树脂醇(15)和熊果酸(16)。该研究首次对黄脉九节的化学成分进行了系统研究,除化合物6和9为首次从黄脉九节中分离得到以外,其他化合物均为首次从九节属植物中分离得到。     

滇龙胆GrGPPS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GrGPPS,进行序列特征分析和原核表达。方法 根据三年生滇龙胆转录组GrGPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到GrGPPS cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS,转入Escherichia coli Rosetta（DE3）中,在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下进行表达。结果 GrGPPS cDNA全长1 107 bp,编码369个氨基酸;序列分析表明,GrGPPS基因是异戊烯基合成酶家族的成员;氨基酸序列系统发育分析表明,GrGPPS与金鱼草AmGPPS亲缘关系最近;构建pGEX-4T-1-GrGPPS重组质粒,获得稳定的pGEX-4T-1-GrGPPS原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论 克隆了GrGPPS基因,建立pGEX-4T-1-GrGPPS稳定的原核表达体系,为进一步纯化和鉴定GPPS蛋白并研究其结构和功能奠定基础。     

全萼秦艽的生药学研究

目的:对全萼秦艽和秦艽进行生药学的比较研究,为全萼秦艽的进一步开发和利用提供参考。方法:利用生药学鉴定方法,从微形态、形态及理化等方面对全萼秦艽和秦艽进行系统分析和评价。采用HPLC测定獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量,流动相甲醇-水梯度洗脱,检测波长254 nm。结果:全萼秦艽的内、外周皮的木栓细胞只有1层。全萼秦艽及秦艽中龙胆苦苷质量分数分别为6.24%和8.51%,獐牙菜苦苷依次为0.26%和0.36%。结论:全萼秦艽在生药学特征方面与秦艽存在部分差异,为全萼秦艽资源的开发利用提供了实验依据。     

宁夏栽培秦艽与野生秦艽有效成分的比较

目的:通过对宁夏栽培秦艽不同品种与野生秦艽有效成分的比较,评价宁夏栽培秦艽的质量.方法:采用《中国药典》2010年版一部方法测量龙胆苦苷和马钱苷酸的含量;采用全自动氨基酸分析仪测定其氨基酸的含量;采用蒽酮-硫酸法测定其多糖的含量.结果:宁夏栽培的3种秦艽龙胆苦苷、马钱甘酸的含量都高于《中国药典》规定的限度;与野生秦艽相比,所含氨基酸的含量有显著性差异;多糖的含量无显著性差异.结论:宁夏栽培的3种秦艽品质良好,对于秦艽氨基酸和多糖的药用价值,可以进一步的研究开发和利用.     

小秦艽和秦艽核型的比较研究

 目的首次对小秦艽和秦艽的核型进行比较研究,为其遗传和进化提供了进一步的细胞学证据。方法根尖用0.002mol·L^-1的8-羟基喹啉溶液预处理5.7h,用2.5%混合酶液,于25℃下酶解1.6h,低渗处理3h(置于冰箱内),然后用空气干燥法制片。结果小秦艽的核型公式是K(2n)=26=2M+24m,属于"1A"型,染色体相对长度组成为2n=26=2L+10M₂+12M₁+2S;秦艽的核型公式是K(2n)=26=2M+20m+4sm,属于"2B"型,染色体相对长度组成为2n=26=6L+6M₂+8M₁+6S。结论小秦艽的核型与秦艽相比较,秦艽较为进化。     

UPLC-Q-TOF-MS分析苗族药红花龙胆化学成分

目的:利用超高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对苗药红花龙胆95%乙醇提取物的正丁醇萃取部位化学成分进行分析鉴定。方法:采用Waters BEH-C18色谱柱(2. 1 mm×50 mm,1. 7μm);流动相0. 01%甲酸水-0. 01%甲酸乙腈,梯度洗脱;柱温30℃;流速0. 4 m L·min~(-1)。质谱使用ESI离子源,正负离子模式下采集数据,结合龙胆属相关文献以及对照品信息进行数据分析。结果:从红花龙胆中共鉴定出化合物33个,包括环烯醚萜类10个,酚酸类6个,黄酮类5个,三萜类6个,苯甲酸碳苷类1个,吡喃酮类1个,其他类4个。其中24个化合物为首次从红花龙胆中发现,分别为阿魏酸,去甲基雏菊叶龙胆酮,3S,5R,6R,9S-tetrahydroxymegas-tigmane,雏菊叶龙胆酮,龙胆二糖,当药苷,secoxyloganin,α-香树脂醇或β-香树脂醇,28-羟基-α-香树脂醇(28-羟基-β-香树脂醇或24-羟基-羽扇豆醇),去甲-当药苷,槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷,3-O-乙酰氧基熊果醇,2'-(2,3-二羟基苯甲酰)-龙胆苦苷,龙胆三糖,gmephiloside,异荭草苷-4'-O-葡萄糖苷或异荭草苷-4'-O-葡萄糖苷,rindoside,macophyllosides A,macophyllosides B,rhodanthenone,secologanoside,gentiside F,gentiside G和花色素。结论:UPLC-Q-TOF-MS技术能够快速准确地鉴定红花龙胆的化学成分,为其质量评价和应用开发提供了参考。