逆转录病毒介导PTEN基因抑制人肝癌细胞系的生长

目的 研究外源性PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC的细胞周期、增殖及裸鼠致瘤能力的影响，探索肝癌基因治疗新途径。方法 将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染HHCC细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养，以免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况，应用流式细胞仪、电子显微镜、生长曲线测定等方法研究PTEN基因对肝癌细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响。结果 稳定转染PTEN基因的HHCC肝癌细胞中PTEN蛋白稳定表达，细胞周期明显改变，细胞从G1期到S期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性下降70．6％裸鼠致瘤能力抑制率72．2％。结论 转染外源性PTEN基因可阻止HHCC肝癌细胞由G1期进入S期，并抑制肿瘤细胞增殖。     

血管内皮生长因子反义RNA抑制人喉鳞癌的生长

目的　观察血管内皮生长因子1 6 5反义 RNA对人喉鳞癌细胞 Hep- 2的作用 ,探讨其治疗喉癌的可行性 .方法　采用亚克隆技术 ,构建并鉴定反义 VEGF1 6 5真核表达载体 ;重组质粒转染人喉鳞癌细胞 Hep- 2后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,利用原位杂交、EL ISA、激光共聚焦、图像分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后 Hep- 2细胞的生物学性状和致瘤性的改变 .结果　构建的 VEGF1 6 5反义真核表达载体在 Hep- 2细胞中获得表达 ,转染后的细胞 VEGF1 6 5的表达下降 70 % ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和血管生成能力明显下降 ,实验组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为 (736± 2 6 2 ) ,(74 4 0± 335 )和 (772 0± 35 0 ) mm3(P<0 .0 1) ,微血管密度分别为 (9.6± 5 .4 ) ,(45 .5± 8.4 )和 (48.4± 7.6 ) mm- 2 (P<0 .0 1) .结论　 VEGF1 6 5反义 RNA能够显著减少喉癌细胞内 VEGF1 6 5的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,有望成为抗喉癌的新基因治疗手段 .     

VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子,vascular endothelial growth factor）真核表达载体,研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法用阳性脂质体介导的基因转染技术,将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系,观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后,斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比,G2/M期细胞增加(0.39),而S期细胞减少(0.54);克隆形成率(2.2%)低于未转染细胞(4.0%);肿瘤细胞接种裸鼠后33 d时,VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136) mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长,另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

降低端粒酶表达对人喉癌细胞系Hep-2生长的影晌

目的：用表达端粒酶反义RNA的方法研究端粒酶在喉癌细胞生长中的作用。方法：将端粒酶反义RNA真核表达载体，pBBS212-hTR转染入人喉癌Hep-2细胞系中，采用端粒重复扩增法测定端粒酶活性，用MTT法及流式细胞仪检测细胞周期，并用电镜观察细胞生长状况。结果：端粒酶反义RNA表达后能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性，抑制细胞增殖并促进其凋亡.结论：以端粒酶反义RNA降低端粒酶的方法对人喉癌细胞系Hep-2的生长有明显抑制作用。     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

GFP共表达的重构型Caspase-3基因对Hep-2细胞的作用

目的:探讨GFP共表达的Caspase-3基因的表达对人喉癌细胞Hep-2的凋亡诱导作用. 方法:应用DNA重组技术将重构型 Caspase-3基因亚克隆至带有GFP报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中,脂质体介导转染人喉癌细胞Hep-2,通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达;荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化; MTT法检测转染Caspase-3基因对Hep-2细胞生长的影响. 结果:RT-PCR方法证实重构型Caspase-3基因可在Hep-2细胞内表达,形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征,MTT法结果表明Caspase-3对Hep-2的细胞生长有抑制作用. 结论:重构型caspase-3对喉癌细胞Hep-2的生长有抑制作用,并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡.     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

胃肠道间质瘤中C-kit原癌基因突变体的构建及功能研究

目的:构建含突变C-kit基因cDNA的真核表达质粒并行进一步的功能分析.方法:用RT-PCR方法从人胎脑组织克隆野生型C-kit基因蛋白编码区cDNA.根据胃肠道间质瘤中检测出的C-kit基因突变序列,体外突变野生型C-kit cDNA得到突变型C-kit cDNA,与pcDNA3重组成真核表达质粒,并用脂质体法稳定转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cell,HEK)293细胞系,G418加压筛选出阳性克隆;用Western印迹法检测转染细胞KIT蛋白表达,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测转染HEK 细胞后细胞周期改变,并观察稳定转染突变型重组质粒人胚肾细胞在裸鼠内的成瘤性.分别设转染pcDNA3空白质粒和野生型的C-kit cDNA真核表达质粒的HEK细胞做为对照.结果:构建了突变型C-kit cDNA与pcDNA3的真核表达质粒; 功能检测分析表明:细胞生长曲线显示与对照组相比,实验组的生长速度明显增快;MTT比色显示,与对照组相比实验组细胞增殖活性显著增强;细胞周期检测结果显示,处于增殖期细胞(S G2-M)比例显著高于对照组;体内结果显示转染突变型C-kit基因的HEK细胞在裸鼠体内成瘤.结论:C-kit原癌基因突变体可促使人类细胞生长加快,增殖活性明显增强,并可以使更多的细胞由静止期进入增殖期, 并可使人胚胎肾细胞发生恶性转化,提示C-kit基因突变有可能是引起胃肠道间质瘤恶性转化的关键机制之一.     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达

目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达。结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

NDRG2对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：观察NDRG2（N—myc downstream regulated gene 2）对于乳腺癌细胞系增殖的影响．方法：采用脂质体转染法将NDRG2基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3,经G418筛选后获得稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系SK—BR-3／NDRG2-flag及仅转染载体的SK—BR-3／pcDNA3．1（＋）．应用Western Blot检测NDRG2在转染细胞中的表达;应用平板克隆形成试验、MTT、流式细胞仪检测转染前后细胞增殖能力的差异．结果：成功建立了稳定高表达NDRG2的亚克隆细胞系SK—BR-3／NDRG2-flag;NDRG2的高表达导致了乳腺癌细胞系增殖能力减弱（P〈0．01）：细朐周期阳滞存G0／G1期．结论：存乳腺痛细胞系SK—BR-3中,过表达NDRG2可有效抑制细胞增殖并导致细胞周期的阻滞．     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165基因修饰的可行性。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞,分别在脂质体LipofectamineTM2000和新型的阳离子聚合物Sofast介导下行pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓基质细胞,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过免疫细胞化学鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果脂质体LipofectaminTM和新型阳离子聚合物Sofast介导转染的阳性细胞率分别为11.34%和11.42%,两者无明显差异。而细胞存活率分别为74.60%和85.88%,后者稍高于前者(P<0.05)。结论真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165可以成功地在骨髓基质细胞中表达,新型阳离子聚合物Sofast的转染效率与传统的脂质体无明显差异,而细胞毒性略小于传统的脂质体。     

辣根过氧化物酶/吲哚乙酸系统作为基因导向性酶前体药物疗法的研究

目的:研究辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)系统作为基因导向性酶前体药物疗法(GDEPT)体外作用于人喉鳞癌Hep-2细胞株所产生的细胞毒性作用。方法:构建pcDNA3.1-HRP,将其瞬时转染Hep-2细胞后,Western blotting检测HRP蛋白的表达,MTT法检测加药IAA后对细胞增殖的影响。结果:pcDNA3.1-HRP构建成功,瞬时转染Hep-2细胞后Western blotting能检测到HRP蛋白的表达,MTT法显示HRP/IAA系统能较明显抑制细胞增殖。结论:HRP/IAA系统具备一定的作为基因导向性酶前体药物疗法治疗肿瘤的潜力。     

转染血管内皮生长因子基因对大鼠任意皮瓣成活的影响

OBJECTIVE: To investigate the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transfection on survival of the random skin flap in rats. METHOD: Thirty SD rats were randomized equally into 3 groups: pcDNA3-VEGF165, pcDNA3 and control groups, with the former two groups transfected via liposome with pcDNA3-VEGF165 and pcDNA3 respectively 48 h before and during the operation. Ischemic random skin flaps ( 1 cmx7 cm) were constructed from the rats. Seven days later, the amount of viable tissue within the flap was measured by planimetry. After the animals were killed, and specimens from the random skin flaps were harvested for immunohistologic evidence of VEGF protein expression and for HE staining to examine the microvascular growth. RESULTS: The results of tissue survival planimetry of the skin flap of pcDNA3-VEGF165, pcDNA3 and control groups were 48.46% +/-3.35%, 30.20%+/-2.16%, and 31.35% +/-1.99%, which were highest in the VEGF- transfected group (P<0.05), in which immunohistochemical staining revealed increased deposition of VEGF in comparison with the other control groups P<0.05 . The VEGF group had also higher average vessel number as compared with the vector and control group (107.72+/-9.42 vs 91.35+/-7.28 and 89.85+/-7.66, P<0.05), and smaller average vessel lumen diameter (25.76+/-3.23 microm vs 32.12+/-1.58 microm and 33.49+/-2.29 microm, P<0.05). CONCLUSION: pcDNA3-VEGF165 transfection may enhance the survival of the ischemic skin flaps and achieve VEGF expression in the flaps in rats.     

鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达

目的：构建鼠源性血管抑素agniostatin cDNA真核表达载体,转梁人胃癌细胞株SCG7901,检测蛋白表达,方法：采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )-angiostatin,酶切鉴定和测序,彩用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901,G418抗性筛选,Western blot检测血管抑素的表达,结果：酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素直核表达载体,经G418筛选和Western blot检测得到表达血管抑素的细胞株,结论：真核表达载体pcDNA3.1( )-angilstatin转导的人胃癌细胞肥够表达血管抑素蛋白,在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值。     

微小RNA136过表达对结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6含量及细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建携带微小RNA136(mir136)的真核表达载体并将其转染人结直肠癌细胞,观察外源性mir136表达对人结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6表达及细胞增殖活性的影响.方法 提取人肾上皮HEK293细胞基因组DNA,PCR扩增包含mir136前体序列的DNA片段并构建重组载体,采用阳离子脂质体法将重组载体转染人结直肠癌HCT116细胞.转染后48h,采用实时定量PCR法检测细胞内mir136含量变化,以蛋白质印迹法检测细胞中S100A6蛋白的表达;转染后24和48h,采用CCK 8试剂盒检测肿瘤细胞增殖活性;转染后48 h,以双染法检测细胞凋亡情况.结果 成功构建重组mir136真核表达载体并转染HCT116细胞.转染后48 h,重组载体转染组HCT116细胞内mir136相对表达量高于未转染组(P＜0.01),而S100A6蛋白的相对表达量则低于未转染组(P＜0.01).同时,重组载体转染组HCT116细胞增殖活性较未转染对照组降低(P＜0.05),而细胞凋亡则较未转染对照组增加(P＜0.01).结论 Mir136可能通过抑制S100A6基因表达而抑制结直肠癌细胞增殖活性,同时引起细胞的凋亡.     

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究

目的 研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法 PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达栽体pcDNA3．1（-）CMVCDglyTK，XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定，测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株，RT—PcR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC＋GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因，RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段。West—era-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5一FC、GCV、5-FC＋GCV干预下生长受到抑制，5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论 CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

12-ACS/pcDNA3.1-VEGF121纳米粒的制备及应用

目的 利用基因工程技术构建的pcDNA31-VEGF121真核表达质粒,制备由12-烷基化壳聚糖包裹的纳米粒,并将其在体外对基因DNA的保护作用进行检验. 方法 采用碱裂解法白转化阳性细菌菌液中提取出pcDNA3.1-VEGF121真核表达质粒;采用复凝聚法制备基因-壳聚糖纳米粒12-ACS/pcDNA31-VEGF1...