果糖通过激活Akt信号通路促进3T3-L1细胞的脂肪分化

目的:研究果糖(fructose)对3T3-L1前脂肪细胞分化过程的影响及其作用机制。方法:对体外培养的3T3-L1前脂肪细胞给予鸡尾酒法诱导脂肪分化,并使用1 g/L的果糖进行诱导干预。油红O染色法定量分析细胞内的脂质含量;RT-qPCR法检测脂肪分化过程中脂滴包被蛋白2(Plin2)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)α和C/EBPβ的mRNA表达水平;Western blot检测脂肪分化标志蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪细胞蛋白2(αP2)的蛋白表达水平。结果:与单纯用分化培养基(DM)的对照组相比,实验(DM+fructose)组的脂肪细胞体积及胞质内脂滴积累量显著增加,脂肪分化标志蛋白PPARγ和aP2的表达水平显著上调(P0.01),Plin2、C/EBPα和C/EBPβ的mRNA表达水平亦显著上调(P0.05)。此外,加入果糖之后Akt信号通路中的关键分子Akt的磷酸化水平显著增加(P0.01),加入Akt特异性阻断剂之后,PPARγ和aP2的表达水平显著下调。结论:果糖能够促进3T3-L1细胞的脂肪分化,可能是通过激活Akt信号通路实现的。     

甘氨酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响

目的：探讨甘氨酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响及其机制。方法:诱导分化3T3-L1脂肪前体细胞为成熟的脂肪细胞，肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导建立脂肪细胞的胰岛素抵抗模型，以罗格列酮为阳性对照，观察甘氨酸干预后胰岛素受体底物-1（IRS-1）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因的表达。结果:正常对照组脂肪细胞IRS-1mRNA和PPARγ mRNA的表达最强；TNF-α组IRS-1mRNA和PPARγ mRNA表达显著低于正常对照组；TNF-α加罗格列酮组与TNF-α加甘氨酸组相似，IRS-1mRNA和PPARγ mRNA表达显著高于TNF-α组。结论:甘氨酸对TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗具有抑制作用，其机制与其增强IRS-1、PPARγ基因的表达有关。     

丝瓜络多糖对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

目的:分离提纯丝瓜络多糖,观察其对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法:采用热水浸提法和DEAE-cellulose柱层析法对丝瓜络多糖进行初步分离和提纯,并对分离组分进行红外光谱分析。运用油红O染色法,观察丝瓜络多糖对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,并通过RT-q PCR观察3T3-L1前脂肪细胞分化时CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ,PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)mRNA的表达情况。结果:经DEAE-cellulose柱层析法分离得到2个多糖组分,丝瓜络提取物Ⅰ(RLFⅠ)和丝瓜络提取物Ⅱ(RLFⅡ),红外光谱分析结果表明2个组分均为多糖类物质。RLFⅠ具有显著抑制3T3-L1前脂肪细胞分化及甘油三酯合成的作用(P0.05),RLFⅡ则无显著效应。与对照组相比,RLFⅠ处理组3T3-L1前脂肪细胞C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平明显降低(P0.05)。结论:丝瓜络多糖RLFⅠ具有显著抑制3T3-L1前脂肪细胞分化的能力,其作用机制可能与下调脂肪细胞分化转录因子C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα有关。     

硫化氢抑制小鼠胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞系抵抗素的分泌

目的观察硫化氢(H2S)是否通过AMPK信号通路影响小鼠胰岛素抵抗3 T3-L1脂肪细胞系抵抗素的分泌。方法将细胞分为对照组、胰岛素抵抗3T3-L1组和50μmol/L Na HS组,利用ELISA法检测抵抗素(resistin)的分泌,Western blot检测AMP激活的蛋白激酶(AMPK)及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)磷酸化蛋白的表达,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测resistin及AMPK mRNA表达。结果与对照组比较,给予Na HS后抵抗素分泌明显降低(P0.05)。正常和胰岛素抵抗细胞中AMPK和ACC磷酸化蛋白表达显著增加(P0.05)。AMPK通路特异性阻断剂compound C可减弱Na HS对AMPK及ACC蛋白磷酸化的作用,且降低正常和胰岛素抵抗细胞抵抗素的分泌。结论 H2S可能通过激活AMPK通路来抑制小鼠正常和胰岛素抵抗3 T3-L1脂肪细胞的抵抗素分泌。     

促酰化蛋白诱导的前脂肪细胞分化过程中转录因子表达的时序性研究

目的：观察促酰化蛋白（ASP）诱导3T3-L1前脂肪细胞的分化过程，转录因子PPARγ、C/EBPδ、C/EBPα mRNA表达的强度及时序性。 方法： 以3T3-L1前脂肪细胞为实验对象，用ASP代替经典激素鸡尾酒诱导刺激中的胰岛素，即促酰化蛋白、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤和地塞米松（ASP+IBMX+DEX）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化，分别在诱导分化1 d、2 d、4 d、6 d、8 d收获细胞，采用RT-PCR法检测ASP诱导3T3-L1前脂肪细胞分化过程中转录因子PPARγ、C/EBPδ、C/EBPα mRNA表达的情况。 结果： PPARγ mRNA在诱导分化1 d时有低水平表达，在诱导分化过程中表达逐步升高，在终末分化阶段仍保持高水平表达。C/EBPδ mRNA在诱导分化1 d时有中等水平表达，在诱导分化2 d时表达水平最高，诱导分化4 d时表达明显减少，在诱导分化6 d和8 d，检测不到C/EBPδ mRNA的表达。C/EBPα mRNA在诱导分化1 d仅有低水平表达，在诱导分化过程中表达逐步升高，在终末分化阶段仍保持高水平表达。IBMX+DEX诱导前脂肪细胞分化过程中，PPARγ、C/EBPδ和C/EBPα mRNA分化早期也有一定升高，但明显低于ASP诱导的转录因子的表达。 结论： ASP对转录因子C/EBPδ、C/EBPα和PPARγ表达的时序性影响，可能是ASP诱导前脂肪细胞分化的重要分子机制之一。     

PGC1α协同PPARγ调节CIDEC基因在小鼠脂肪细胞系中表达

 目的 鉴定CIDEC的表达能够被PPARγ和PGC1α共激活, 检测其在脂肪代谢中的重要调控作用。方法 构建5’删切和顺式原件突变的启动子,运用HepG2细胞中双荧光报告基因实验检测PPARγ和PGC1α对CIDEC的共激活作用并确定顺式作用原件。运用PPARγ特异激动剂pioglitazone刺激3T3-L1细胞检测CIDEC的mRNA水平。在3T3-L1细胞系中,过表达CIDEC,检测脂肪合成及能量代谢相关基因的mRNA水平。通过腺病毒感染在小鼠肝原代细胞中过表达CIDEC,检测肝脏细胞中脂肪变化。结果 PPARγ和PGC1α能够显著激活CIDEC的启动子。过表达CIDEC后在脂肪细胞中脂类合成相关基因FAS上调3.47±0.17倍（p<0.05）,ACC上调3.95±0.57倍（p<0.05）,在肝原代细胞中CIDEC促进脂滴的生成。结论 CIDEC过表达能够被PPARγ促进并且被PGC1α共激活,在体内起到促进脂肪积累的作用。     

miR-202通过抑制PGC1β表达促进3T3-L1前脂肪细胞分化

目的观察miR-202对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及可能的机制。方法通过慢病毒感染构建稳定表达AMO-miR-202和乱序对照miRNA细胞系,随后诱导分化。至分化的第9天,油红O染色观察细胞内脂滴的情况;RT-PCR检测过氧化物酶体激活增殖受体γ2(PPARγ2)和a P2的基因表达;Western blot检测PPARγ2、a P2和miR-202靶基因PPARγ辅助活化因子1β(PGC1β)蛋白表达。结果经293T细胞慢病毒包装AMO-miR-202、乱序对照miRNA,荧光显微镜下可见约80%~90%荧光细胞;将上述2组病毒液分别感染3T3-L1前脂肪细胞后,可见约70%~80%荧光细胞。AMO-miR-202组细胞内脂滴及PPARγ2和a P2的mRNA表达显著低于乱序对照组和对照组(P<0.05)。与乱序对照组和对照组相比,AMO-miR-202组PGC1β蛋白表达显著增加(P<0.05),PPARγ2和a P2蛋白表达显著降低(P<0.01),而乱序对照组和脂肪细胞组上述指标无明显差异。结论 miR-202可能通过抑制PGC1β、提高PPARγ2和a P2的表达促进3T3-L1前脂肪细胞分化。     

小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中过氧化物酶增殖物激活受体γ与CCAAT/增强子结合蛋白α的表达

背景:目前关于脂肪细胞分化的分子作用机制的研究较少。过氧化物酶增殖物激活受体和CCAAT/增强子结合蛋白家族的转录调控因子可诱导前脂肪细胞表达促进其分化成熟的多个转录因子,但其作用机制却罕见报道。目的:观察小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞过程中过氧化物酶增殖物激活受体γ和CCAAT/增强子结合蛋白α的表达,以及在脂肪细胞分化过程中的变化。方法:体外培养3T3-L1前脂肪细胞,采用经典激素鸡尾酒诱导法诱导细胞分化,诱导剂为1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松和胰岛素。诱导后0,2,4,6和8d,用油红O染色和染色比色法分析脂肪细胞的分化程度,采用实时PCR和Western blot技术检测不同时间点的过氧化物酶增殖物激活受体γ和CCAAT/增强子结合蛋白α的表达。结果与结论:在前体脂肪细胞的分化过程中,随时间的延长相对脂肪含量、过氧化物酶增殖物激活受体γ与CCAAT/增强子结合蛋白α表达水平均明显升高(P0.01)。说明在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞过程中,过氧化物酶增殖物激活受体γ与CCAAT/增强子结合蛋白α对细胞分化可能起促进作用。     

甘露聚糖结合凝集素(MBL)对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的调节作用及机制

目的研究甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的调节及其机制。方法体外诱导3T3-L1前脂肪细胞成脂分化,同时给予不同浓度的MBL(0、1、10、20μg/ml)干预。CCK-8法检测细胞增殖能力变化,油红O染色和细胞内甘油三酯含量测定法分析脂质积累情况。Western blot及qRT-PCR检测脂肪细胞成脂分化相关因子PPARγ及C/EBPα的蛋白质及mRNA表达水平。Western blot分析脂肪合成调控信号分子Akt的表达及磷酸化。结果实验组各浓度MBL(0、1、10、20μg/ml)对3T3-L1前脂肪细胞增殖都无影响。3T3-L1前脂肪细胞诱导分化3 d,甘油三酯检测发现MBL处理组细胞内甘油三酯水平下降,并呈剂量依赖关系;油红O染色结果进一步显示,MBL处理组的脂滴数量显著减少,吸光度值也显著降低,同样呈现浓度依赖关系。Western blot及qRT-PCR检测结果证实,MBL处理组PPARγ和C/EBPα的蛋白质及mRNA表达水平均显著下降,呈剂量依赖性。在MBL干预下,Akt的磷酸化水平也明显下调。结论MBL通过Akt信号通路调控3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。     

泛素蛋白酶系统通过稳定PPARγ调节脂肪细胞分化

目的:探讨泛素蛋白酶系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)在体外脂肪细胞分化中的作用。方法:常规方法诱导前脂肪细胞分化为脂肪细胞,Western blot检测蛋白质表达,免疫共沉淀检查蛋白质间结合,油红O染色检测脂肪细胞中的脂质,RT-PCR检测mRNA表达。结果:UPS抑制剂硼替佐米可抑制3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞,表现为细胞内脂质含量降低以及脂肪细胞标志蛋白mRNA表达的降低。蛋白激酶G激动剂西地那非可激活UPS,并增强脂肪细胞的分化。抑制UPS可降低热休克蛋白90(HSP90)和过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)间的结合;同时降低细胞可溶性组分中HSP90和PPARγ的表达,增强其在不可溶性组分中的表达。HSP90特异性的N末端抑制剂格尔德霉素可抑制西地那非促进的PPARγ表达和脂肪细胞的分化。结论:泛素蛋白酶系统通过HSP90调节PPARγ的表达,从而影响脂肪细胞的分化。     

Fucoxanthin and its metabolite, fucoxanthinol, suppress adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells

Fucoxanthin is a major carotenoid found in edible seaweed such as Undaria pinnatifida and Hijikia fusiformis. We investigated the suppressive effects of fucoxanthin and its metabolite, fucoxanthinol, on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes to adipocytes. Fucoxanthin inhibited intercellular lipid accumulation during adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells. Furthermore, fucoxanthin was converted to fucoxanthinol in 3T3-L1 cells. Fucoxanthinol also exhibited suppressive effects on lipid accumulation and decreased glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity, an indicator of adipocyte differentiation. The suppressive effect of fucoxanthinol was stronger than that of fucoxanthin. In addition, in 3T3-L1 cells treated with fucoxanthin and fucoxanthinol, peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma), which regulates adipogenic gene expression, was down-regulated in a dose-dependent manner. These results suggest that fucoxanthin and fucoxanthinol inhibit the adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells through down-regulation of PPARgamma. Fucoxanthinol had stronger suppressive effects than fucoxanthin on adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells.     

番石榴叶总三萜改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

 目的: 观察番石榴叶总三萜(TTPGL)对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的改善作用,并探讨其可能的作用机制。方法: 培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导其分化,给予TTPGL(0.3、1、3、10 μg/L),并设溶媒(0.1% DMSO)组、阳性药正钒酸钠(Van,10 μmol/L)组、正常对照(control)组和模型(model)组,药物作用48 h。MTT法检测药物对前脂肪细胞活力的影响,油红O染色法观察其对细胞分化的影响。建立IR模型后,药物处理48 h,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测IR脂肪细胞上清液中葡萄糖消耗量;比色法检测游离脂肪酸(FFA)水平;ELISA法检测脂肪因子分泌水平;real-time PCR检测IR脂肪细胞蛋白酪氨酸激酶1B(PTP1B)的mRNA表达量;Western blot检测磷酸化胰岛素受体底物1/胰岛素受体底物1(p-IRS-1/IRS-1)和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)的蛋白水平。结果: 与溶媒组比较,TTPGL显著提高了前脂肪细胞的活力并抑制其分化(P < 0.01)。与IR溶媒组比较,无论在基础状态下还是胰岛素刺激状态下,TTPGL(1-10 μg/L)均显著地促进了IR脂肪细胞葡萄糖消耗(P < 0.01);TTPGL(0.3~3 μg/L)显著抑制FFA的产生(P < 0.01)。与模型组比较,TTPGL(0.3和3 μg/L)显著增加IR脂肪细胞脂联素的分泌(P < 0.05)并抑制TNF-α的分泌(P < 0.01),TTPGL(3 μg/L)对抵抗素的分泌有显著抑制作用(P < 0.05),对瘦素分泌无显著作用;TTPGL(3 μg/L)显著下调IR脂肪细胞PTP1B的mRNA表达(P < 0.01);TTPGL(3 μg/L)极显著上调p-IRS-1/IRS-1的水平;TTPGL(0.3和3 μg/L)显著上调p-Akt/Akt的蛋白水平(P < 0.05)。结论: TTPGL具有显著改善3T3-L1脂肪细胞IR的作用,其作用机制可能与TTPGL下调了IR脂肪细胞PTP1B mRNA的表达、同时上调p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的蛋白水平有关。     

resistin基因过表达影响3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢

目的观察resistin基因过表达对3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢、糖代谢的影响。方法构建大鼠resistin真核表达载体并转染3T3-L1前体脂肪细胞,获得稳定表达resistin基因的细胞株;采用油红O染色,观察脂肪细胞分化及脂质积聚情况;采用逆转录PCR技术,检测脂肪细胞分化标志基因及葡萄糖转运体4（glucose transporter4,GLUT4）基因表达变化;采用全自动生化仪比色法,检测脂肪细胞内甘油三酯（triglyceride,TG）、游离脂肪酸（free fatty acids,FFAs）的含量变化。结果（1）resistin基因过表达脂肪细胞中,脂滴出现时间提前,且细胞内布满了小而多的圆形脂滴;（2）resistin基因过表达脂肪细胞中,分化中、晚期标志基因C/EBPα、FAS的mRNA表达水平明显上调,分化早期标志基因Pref-1的表达则明显下调;（3）re-sistin基因过表达脂肪细胞中,胞质内TG、FFAs含量均显著增加;（4）resistin基因过表达脂肪细胞中,分化第2、4、8d的GLUT4基因mRNA表达水平间无显著变化,与正常脂肪细胞中的表达水平差异也无统计学意义。结论resistin基因过表达能够显著干扰3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢,有助于肥胖和胰岛素抵抗的发生,而并不影响GLUT4基因的表达。     

gAd对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖分解代谢关键酶表达的影响

目的通过检测3T3-L1脂肪细胞内糖酵解关键酶的表达情况,探讨课题组前期制备的脂联素球状结构域（gAd）对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖分解代谢的影响。方法用课题组前期制备的gAd（质量浓度依次为10、50、100、300、1 000 ng/mL）干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,干预结束后以实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组细胞糖酵解关键酶包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-1及丙酮酸激酶转录表达情况,以Western blot法检测各组细胞丙酮酸激酶翻译表达情况。结果gAd干预组（5个浓度）己糖激酶的转录表达[（2.02±0.16）、（3.47±0.29）、（4.22±0.33）、（5.83±0.45）、（6.65±0.51）倍]显著高于对照组（1.00±0.00）（F=125.789,P〈0.001）,6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶的转录表达也显著高于对照组（F分别为85.399和113.661,P均〈0.001）,同时丙酮酸激酶的翻译表达（12.430%±0.800%、1.700%±3.010%、26.570%±1.114%、52.600%±2.910%、71.130%±10.600%）也显著高于对照组（8.000%±1.610%）（F=161.007,P〈0.01）。结论 gAd促进3T3-L1脂肪细胞摄取胞外葡萄糖的同时,激活了细胞内葡萄糖的分解供能代谢途径。     

α-Naphthoflavone inhibits 3T3-L1 pre-adipocytes differentiation via modulating p38MAPK signaling

α-Naphthoflavone (α-NF) is a synthetic flavonone derivative and is well known as a potent inhibitor of aromatase in a variety of systems. However, its role in lipid metabolism remains far from understood. The aim of current study was to investigate the effects of α-NF on 3T3-L1 pre-adipocytes differentiation and the mechanism through which it acts. Treatment of 3T3-L1 cells with α-NF in conjunction with a hormone cocktail resulted in α-NF mediated suppression of adipocyte differentiation in a dose dependent manner. At the molecular level, our findings demonstrated that α-NF inhibited the mid and late phase, but not the early phase of adipogenic markers expression during 3T3-L1 adipogenesis. The phosphorylation of p38 was activated upon adipogenic stimulation, yet was substantially suppressed by α-NF treatment. α-NF also synergistically inhibited expression of the adipogenic marker peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) expression together with p38 selective inhibitor, SB203580. Our study demonstrated for the first time that α-NF is capable of suppressing 3T3-L1 adipocyte differentiation and that this effect likely occurs through repression of the p38MAPK signaling pathway.     

ERK5信号通路介导流体剪切力对成骨细胞BMP2，BMP7mRNA的表达影响

目的：观察流体剪切力对MC3T3-E1成骨细胞BMP2,BMP7mRNA的表达影响,并探讨ERK5信号通路在其中的作用。方法：应用不同浓度的ERK5特异性阻断剂BIX02188干预成骨细胞,MTT比色法检测酶标仪490nm吸光度,观察成骨细胞增殖情况以及ERK5mRNA的表达。并采用生理强度为12dyne／cm^2的流体剪切力干预成骨细胞,实时荧光定量PCR检测BMP2,BMP7mRNA的表达情况。结果：浓度为15μM的BIX02188干预成骨细胞后,成骨细胞的生长的抑制以及ERK5mRNA的降低呈浓度依赖性。流体剪切力能够明显增加BMP2和BMP7mRNA的表达（P〈0．05）,且该种反应能够被ERK5信号通路阻断（P〈0．05）。结论：ERK5信号通路调控流体剪切力对成骨细胞BMP2,BMP7mRNA的表达。