肿胀激活状态下蛋白激酶C同工酶亚型在胃癌耐药细胞系的亚细胞分布变化及其意义

目的 探讨肿胀激活状态下，传统型蛋白激酶C（cPKC)同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR的表达，亚细胞分布变化及其意义。方法 采用免疫荧光及免疫印迹方法，观察正常状态及持续低渗灌流不同时间cPKC同工酶亚型的亚细胞分布变化，利用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察PKCα与-P-糖蛋白（Pgp)的共表达。结果 在正常状态下，cPKC的4种同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞SCG7901/VCR细胞质及细胞膜均有表达：PKCα在耐药细胞表达呈强阳恬药敏细胞表达呈强阳性，PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性。持续低渗灌流，在耐药系10min已发现有PKCα、PKCγ的移位及细胞体积的增大；30minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；60min时PKCα及PKCγ基本恢复至正常位置。细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα及PKCγ几乎全部一笔勾销 位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；40minPKCα及PKCγ基本恢复至正常位置，细胞体积也恢复正常，而PKCβ1及PKCβα在耐药细胞及药敏细胞的亚细胞分布无明显变化。共聚焦显微镜提示PKCα及PKCγ同工酶亚型参与了Pgp与低渗刺激下细胞共表达，以耐药细胞表达明显。结论 只有PKCα及Pgp表达量有关，而PKCβ1及PKCβⅡ可能与这一过程无关。βββ     

胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶C的表达及活性

目的 观察传统型蛋白激酶C（cPKCs）在胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR1.0、耐药亚系SGC7901／VCR0.3,7901/0.7及药敏细胞系SGC7901表达及活性的变化,以及对细胞内药物浓度的影响。方法 用免疫荧光化学及蛋白印迹方法观察传统型蛋白激酶C在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系的表达;竞争蛋白结合法测定PKC的活性;应用流式细胞仪观察细胞内药物浓度的变化。结果 PKCα,PKCβⅠ,PKCβⅡ及PKCγ在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系均有表达,PKCα在耐药细胞表达呈强阳性,在药敏细胞表达呈阳性;PCKβⅠ及PKCβⅡ在耐药细胞及药敏细胞表达均为阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均为强阳性。免疫蛋白印迹实验证实,随耐药指数的增加,PKCα表达呈逐渐增高的趋势,薄层扫描蛋白印迹带的吸光度（A）分别为9584.17,9421.06,8534.64,8088.79,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ在耐药细胞系、耐药亚系及其药敏细胞系表达无明显变化。PKC活性检测结果提示,随耐药指数的增加,PKC活性呈逐渐增高的趋势,以细胞质及细胞核的PKC活性增高为主。结论 传统型蛋白激酶C在维持胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR的多药耐药中起重要作用且具有同工酶特异性。     

MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C有关

目的：探讨MGr1-Ag维持耐药表型与蛋白激酶C的关系。方法：用免疫细胞化学方法检查MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系的表达；ELISA及点印迹方法检测胃癌SGC7901细胞系及其耐药亚系细胞培养上清中MGr1-Ag的表达；免疫荧光双标记及共聚集赤微镜技术观察MGr1-Ag 与PKCα的相关表达；竞争蛋白结合法检测单克隆抗体MGr1-1对PKC活性的影响。结果：MGr1-Ag在胃癌SGC7901细胞系及耐药亚系均有表达，以耐药细胞表达明显增多；ELISA及点印迹实验证实在表达MGr1-Ag的细胞培养上清中均可检测到MGr1-Ag；耐药细胞PKCα与MGr1-Ag的相关表达较药敏细胞明显增强；单克隆抗体MGr1-1与耐药细胞共同孵育后，耐药细胞PKC的活性减低，以细胞质的PKC降低较明显。结论：MGr1-Ag可能是一种分泌蛋白，Mgr1-Ag维持SGC7901/VCR耐药细胞系的耐药表型可受PKC信号转导通路的调节。     

苦参碱逆转人胃癌细胞株SGC7901/VCR耐药性实验研究

目的 研究苦参碱(Matrine)对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR的多药耐药的逆转效应及其机制.方法 以长春新碱(VCR)诱导的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR为研究对象,MTT法研究苦参碱对体外培养的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR细胞增殖的影响及逆转效应、用间接免疫荧光法经流式细胞仪检测MRP的表达并分析其机制.结果 MTT法显示苦参碱在0.5、1.0、2.0 mg·mL-1浓度下处理SGC7901/VCR细胞72 h后,其生长抑制率依次为10%、15%、32%,且可以逆转SGC7901/VCR对VCR的耐药,呈剂量依赖性,逆转倍数分别为9.4、13.4、24.5倍.0.5 mg·mL-1苦参碱与SGC7901/VCR细胞共同培养24 h后,SGC7901/VCR细胞的MRP表达从(36.00±4.32)%降低至(25.00±3.85)%(P<0.01).结论 苦参碱可以体外逆转人胃癌细胞多药耐药细胞SGC7901/VCR的耐药性,其逆转机制与降低MRP的表达有关.     

Rap1与胃癌多药耐药的相关性

目的探讨Rap1与胃癌多药耐药的相关性。方法采用免疫荧光技术和Westernblot方法检测胃癌细胞SGC7901、多药耐药胃癌细胞SGC7901／VCR和SGC7901／ADR中Rapl的表达。结果胃癌细胞SGC7901、多药耐药胃癌细胞SGC7901／VCR和SGC7901／ADR胞核和胞浆均有Rap1阳性染色,多药耐药胃癌细胞中Rap1表达明显高于亲本细胞SGC7901。结论Rap1与胃癌多药耐药相关。     

NF-κB活化及livin,survivin表达上调与胃癌细胞耐药的关系

目的:探讨核转录调节因子NF-κB活性及凋亡抑制蛋白livin, survivin的表达与胃癌细胞耐药的关系.方法:MTT法检测化疗药物长春新碱(VCR)对胃癌细胞SGC7901及耐药细胞SGC7901/VCR的生长抑制作用;流式细胞仪检测VCR作用后细胞的凋亡率;ELISA法检测NF-κB核转录活性;Western blot检测livin, survivin蛋白表达.结果:化疗药VCR对SGC7901/VCR细胞的生长抑制作用较SGC7901细胞显著降低,VCR作用SGC7901/VCR细胞的凋亡率减少;SGC7901/VCR细胞中NF-KB核转录活性增强(P<0.01);livin, survivin在SGC7901/VCR细胞中表达上调(P<0.05).结论:胃癌细胞SGC7901在化疗药VCR长期诱导后产生的继发耐药可能与NF-κB活化及livin, survivin表达上调有关;NF-κB活化是livin, survivin表达上调可能的调控因素.     

mdr1基因在多药耐药相关的几种人胃癌细胞系的表达

目的探讨mdr1在多药耐药相关的几种人胃癌细胞系中的转录、翻译、P-gp功能变动趋势.方法培养SGC7901/VCR(人胃癌多药耐药细胞亚系)、SGC7901和BGC823(人胃腺癌细胞系)于RPMI1640,用RT-PCR和原位杂交检测mdr1mRNA的表达,用免疫印迹和免疫组化检测P-gp的表达,用流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积.结果半定量RT-PCR显示,SGC7901/VCR mdr1和β-actin吸收峰面积之比为5.63,SGC7901为0.61,BGC823为0.85.杂交信号呈紫蓝色颗粒,分布于胞质.免疫印迹显示SGC7901/VCRP-gp的表达最强,SGC7901最弱.P-gp阳性呈棕黄色颗粒,位于细胞膜上.SGC7901中,少数细胞P-gp表达极强.SGC7901/VCR平均光密度为(1.8310±0.8401),SGC7901为(0.3590±0.2512),BGC823为(0.6260±0.4996)(P＜0.05).SGC7901/VCR阿霉素特异荧光强度为(6.59±50.30),SGC7901为(35.88±14.55),BGC823为(27.44±7.06)(P＜0.001).结论在多药耐药相关的人胃癌细胞系SGC7901/VCR、SGC7901和BGC823中,mdr1基因均表达,P-gp具有药物外排功能,SGC7901/VCR的mdr1表达最强,SGC7901最弱,BGC823居中.     

蛋白激酶C活性、表达及亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药相关性的研究

目的研究多药耐药肿瘤细胞PKC活性、PKC亚型的表达和亚细胞分布与KBV200细胞多药耐药的关系。方法MTT法检测敏感株KB和耐药株KBV200细胞的耐药性；印掺入法测定PKC的活性；Western blot法检测KBV200及其亲本KB细胞株PKC亚型的表达和亚细胞分布。结果长春新碱（VCK）和阿霉素（ADK）对KBV200细胞的IC50值分别高于KB细胞（P〈0．01）；耐药指数（RI）分别为65．03和19．8。KBV200细胞的膜组分、浆组分的PKC活性均较KB细胞高,KBV200细胞的总PKC活性是KB细胞的2．12倍。Western blot结果发现KBV200和KB细胞膜组分及浆组分均有PKCq的表达，且KBV200细胞的表达较KB明显增强。PMA可升高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性，降低浆组分PKC活性、表达（P〈0．01）；PMA可升高VCR、ADK对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。SP可降低PKC活性；SP预孵育使PKCα膜组分和浆组分的表达均降低，可降低VCR、ADK对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。结论KBV200细胞的PKC活性、表达、亚细胞分布与KB细胞有明显差别，这种差别可能与KBV200耐药性的变化密切相关，在PKC亚型中，PKCα的表达明显高于其他亚型，且高于亲本株，提示KBV200细胞中PKCα与多药耐药相关。     

朊蛋白在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中的过表达及其意义

目的 探讨朊蛋白(PrP)在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中过表达及其与胃癌多药耐药性的相关性。方法(1)利用Northern印迹和Western印迹分别从RNA 水平和蛋白质水平检测朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中的表达;(2)借助DNA重组技术构建朊蛋白基因的正反义真核表达载体;(3)通过电穿孔方法将正反义真核表达载体分别转入SGC7901和SGC7901/ADR细胞;(4)以流式细胞仪检测瞬时转染细胞中的阿霉素蓄积和潴留。结果(1)Northern印迹和Western印迹结果提示朊蛋白在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达显著高于其在SGC7901中的表达;(2)将正反义真核表达载体转入SGC7901(命名为PS)和SGC7901/ADR(命名为PA)中,PCDNA3.1空载体转入SGC7901(命名为BS)和SGC7901/ADR(命名为BA);转染48h后检测转染细胞的平均阿霉素荧光强度,阿霉素蓄积BS为8.9±0.7,PS为6.6±0.3,BA为5.5±0.7,PA7.5±0.6,阿霉素潴留BS为8.0±0.7,PS为5.9±0.5,BA5.1±0.7,PA为7.1±0.5,PS与BS相比两组均为P<0.01,BA与BA相比均为P<0.01表达,并对胃癌细胞,具有统计学意义。结论 朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中高表达并对胃癌细胞的药物蓄积有影响。     

Survivin在胃癌SGC7901顺铂耐药中的作用

目的:探讨Survivin在小剂量顺铂长期作用于SGC7901细胞导致细胞耐药中的作用机制.方法:体外诱导建立人胃癌顺铂耐药细胞株SGC7901/CDDP,显微镜下观察SGC7901/CDDP与正常SGC7901细胞株的形态差异,应用RT-PCR技术及Western blot技术分别检测SGC7901/CDDP与正常SGC7901细胞株中Survivin mRNA的表达和 Survivin蛋白的表达.结果:SGC7901/CDDP与正常SGC7901细胞株有明显的形态差异;SGC7901/CDDP 中Survivin mRNA的表达和Survivin蛋白的表达都高于SGC7901细胞.结论:SGC7901对顺铂耐药可能与顺铂诱导SGC7901/CDDP 中Survivin表达增加有关.     

Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in SGC7901/VCR cells by PPARγ activation by troglitazone

Over-expression of P-glycoprotein(P-gp),an ATP-dependent drug efflux pump,represents one of the major mechanisms that contribute to multidrug resistance(MDR) in cancer cells.This study examined the effects of troglitazone,a ligand of peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ),on P-gp-mediated MDR in SGC7901/VCR cells(a vincristine-resistant human gastric cancer cell line).The expression of P-gp was detected by RT-PCR and Western blotting,respectively.The SGC7901/VCR cells were treated with 0.1 ...     

Upregulation of drug sensitivity of multidrug-resistant SGC79 01/VCR human gastric cancer cells by bax gene transduction

Objective To investigate the role of bax in a vincristine （VCR）-induced multidrug-resi stant （MDR） human gastric cancer cell line, SGC7901/VCR, in which the Bax prot ein expression level was significantly lower compared with that in parent cells .Methods A bax eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SGC7901/ VCR cells by lipofectamine, and resistant clones were selected by G418. Western blotting detected Bax expression in transfectants. Tetrazolium blue (MTT) assa y evaluated the differences in drug sensitivity and cell cycle changes of transf ectants were analyzed using flowcytometry (FCM). Results The bax eukaryotic expression vector was constructed and transfected into SGC790 1/VCR cells. Through G418 selection, resistant clones were obtained. Western b lotting demonstrated that the expression of Bax protein was markedly increased i n bax transduced cells. These cells were more sensitive to adriamycin (ADR) and VCR than mock vector transducted cells. Moreover, bax transfection enhanced AD R-induced apoptosis and VCR-induced G(2)/M phase arrest of SGC7901/VCR cells. Conclusion Bax was involved in the MDR of SGC7901/VCR cells.     

胃癌耐药细胞株耐药谱的体外实验

观察胃癌细胞与抗肿瘤药作用后对不同药物耐的耐受情况，方法：胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１在体外分别与长春新碱（ＶＣＲ），５氟尿嘧啶（５－Ｆｕ），阿霉素（ＡＤＭ）及氨甲喋呤（ＭＴＸ）作用，获得ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，ＳＧＣ７９０１／ＡＤＭ，ＳＧＣ７９０１／５－Ｆｕ及ＳＧＣ７９０１／ＭＴＸ４个耐药细胞株。体外细胞毒性实验观察它们对ＶＣＲ，ＡＤＭ，５－Ｆｕ，ＭＴＸ，顺铂（ＣＤＤＰ）以及丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）的敏     

贝母素乙逆转SGC7901/VCR细胞株多药耐药的初步研究

目的研究贝母素乙对胃癌耐药细胞SGC7901/VCR的逆转及诱导凋亡作用。方法采用四甲基唑蓝法(MTT)检测贝母素乙的细胞毒性及耐药逆转效果;采用流式细胞仪检测细胞内阿霉素(ADR)蓄积以及细胞凋亡率的变化。结果贝母素乙可剂量依赖性的的抑制亲本细胞系SGC7901和耐药细胞系SGC7901/VCR的细胞增殖,20μg/mL贝母素乙能够显著提高SGC7901/VCR细胞对化疗药(长春新碱、阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶)的敏感性及细胞内ADR的浓度,贝母素乙和5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合用药后能诱导细胞凋亡,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而逐渐增加,处理48h后的凋亡率最高达44.5%。结论贝母素乙能够作为胃癌多药耐药逆转剂逆转MDR,其机制可能与减少药物外排和诱导细胞凋亡相关。     

他莫昔芬对人胃癌细胞增殖和丝氨酸蛋白酶抑制剂9表达的影响

目的：研究他莫昔芬（TAM）对胃癌细胞雌激素受体α、β（ERα和ERβ）的表达情况及对胃癌细胞增殖和丝氨酸蛋白酶抑制剂9（PI9）表达的影响。方法对前期筛选出的ERα表达阳性胃癌细胞株MNK45、SGC7901（PI9表达阳性）和ERβ表达阳性胃癌细胞株BGC823（PI9表达阴性）,采用免疫荧光化学法检测 TAM 对ERα和ERβ表达的影响,CCK8法检测 TAM 干预后胃癌细胞株的增殖情况,逆转录PCR观察TAM干预后PI9表达的变化。结果 ERα表达于MNK45和SGC7901细胞核上, ERβ表达于BGC823细胞核上,经TAM 干预后 ERα和 ERβ表达均无明显改变;TAM 在0．1～100．0μmol／L 时可明显抑制SGC7901、MNK45的细胞增殖,与阴性对照组比较,差异有统计学意义（P＜0．05）,对BGC823和MNK28的细胞增殖无明显剂量依赖关系;TAM干预后SGC7901的PI9 mRNA的相对灰度值为（0．402±0．020）,MNK45的PI9 mRNA的相对灰度值为（0．359±0．048）,较阴性对照组灰度值均明显降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 TAM 对ERα和PI9阳性表达细胞的增殖抑制作用强于PI9阴性表达细胞,并呈较好的剂量依赖性;TAM 对胃癌的生长抑制作用可能与改善PI9介导的免疫耐受有关。     

雌激素受体alpha和肿瘤转移相关因子1在胃癌细胞中的表达和共定位

目的：观察雌激素受体alpha（ERα）和肿瘤转移相关因子1（MTA1）在胃癌细胞中的表达和共定位,探讨胃癌的发病机制。方法：提取BGC823、SGC7901胃癌细胞蛋白,利用Western blotting 法检测内源性ERα和MTA1的表达,利用共聚焦激光扫描显微镜观察2种胃癌细胞中ERα和MTA1的定位情况。结果：Western blotting 法检测,BGC823、SGC7901胃癌细胞均表达ERα和MTA1;共聚焦激光扫描显微镜观察,ERα和MTA1能够共定位于BGC823和SGC7901细胞的细胞核中。结论：胃癌细胞中表达ERα,并且能够与MTA1共定位在细胞核中。     

Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药的关系

目的：应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关的蛋白质。方法：以胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901／VCR为研究对象，应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）技术分离两种细胞的总蛋白，图像分析识别差异表达的蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及电喷雾串联质谱（ESI-Q-TOF）对差异表达的蛋白质点进行鉴定。Western blot验证差异蛋白质的表达水平，反义核酸技术分析差异蛋白与胃癌耐药的关系。结果：可溶性耐药相关性钙结合蛋白（sorcin）在SGC7901／VCR细胞中高表达，反义核酸抑制sorcin表达可增强SGC7901／VCR对长春新碱的化疗敏感性。结论：Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药密切相关。     

人层粘连蛋白受体调节胃癌细胞多药耐药性的实验研究

目的：探讨相对分子质量为67000的人层粘连蛋白受体（LR）对胃癌细胞多药耐药性（MDR）的调节作用及其机制。方法：应用DNA重组技术构建LR前体蛋白（LRP）的反义RNA表达载体,并借助脂质体将其导入胃癌MDR细胞SGC7901／VCR中。用Western印迹法检测ＬＲ在胃癌细胞中的表达,ＭＴＴ法测定细胞对化疗药物的敏感性,流式细胞仪测定细胞周期以及阿霉素在细胞内的蓄积和潴留。结果：转染LRP反义RNA表达载体显著降低了LR在SGC7901／VCR细胞中的表达。转染细胞（SGC7901／VCR－anLRP)对长春新碱、阿霉素、5－氟尿嘧啶和顺铂的敏感性明显升高,细胞内蓄积和潴留的阿霉素也明显增多。细胞周期分析表明,SGC7901／VCR－anLRP细胞发生了G1期阻滞,并出现了自发性凋亡。结论：LR可能通过影响药物蓄积和细胞凋亡参与对胃癌细胞MDR的调节。