逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用研究

目的 观察逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用，探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染Raji淋巴瘤细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的Raji/CD tk细胞株。采用RT-PCR法检测双自杀基因的表达。MTT法测定转基因组及末转基因组Raji细胞的存活率。结果 双自杀基因在Raji细胞中可稳定表达，联合使用5-氟胞咳暖(5-FC)和无环鸟苷(QCV)对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论 逆转录病毒介导双自杀基因较单一自杀基因具有更强的杀伤作用。     

双自杀基因对Raji淋巴瘤细胞杀伤的增强作用

目的 :观察反转录病毒介导的双自杀基因对 Raji淋巴瘤细胞的杀伤增强作用 ,探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 :通过脂质体将含有双自杀基因的反转录病毒载体 p WZL neo CDglytk导入病毒包装细胞 PA317,经 G4 18筛选后大量培养产病毒的阳性克隆 PA317/ CD+ tk细胞株 ,收集病毒上清 ,浓缩后转染 Raji淋巴瘤细胞 ,再次经 G4 18筛选 ,获得稳定表达双自杀基因的 Raji/ CD+ tk细胞株。用RT- PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物 5 -氟胞嘧啶 (5 - flourocytosine,5 - FC)和 /或无环鸟苷(Ganciciovir,GCV)后 ,MTT法测定细胞的存活率及 CDglytk双自杀基因对 Raji细胞的杀伤作用。结果 :双自杀基因在 Raji细胞中可稳定表达 ,联合使用 5 - FC和 GCV时 Raji细胞的存活率 (13.83% )明显低于单独使用 GCV (5 0 .6 5 % )或 5 - FC(5 7.6 8% )时 ,各组比差异具有显著性 (P<0 .0 1)。结论 :反转录病毒介导双自杀基因对 Raji淋巴瘤的杀伤作用明显增强     

逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞杀伤作用的实验研究

目的：观察逆转录病毒介导的双自杀基因对K562细胞的杀伤作用，探讨慢性粒细胞白血病的基因治疗方法。方法：通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染K562细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的K562／(：D tk细胞株。用RTl_PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine，5-FC)和／或无环乌苷(Ganciciovir，GCv)后MTT法测定转基因组及未转基因组K562细胞的存活率。结果：双自杀基因在K562细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCv对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCv。结论：逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死K562细胞，双自杀基因较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

HSVTK/GCV自杀基因系统治疗乳腺癌的研究

 目的　探讨HSV TK/GCV自杀基因系统对小鼠乳腺癌细胞系MA782 / 5S 810 2体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法　采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2 ,得到带有HSV TK基因的MA782 / 5S 810 2 /TK细胞 ,并将其分别用于体外和体内实验。结果　载体HSV TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示 ,当MA782 / 5S 810 2 /TK细胞数占混合细胞 10 %时 ,低浓度 (10 μg/ml)的GCV就可将 5 0 %左右的肿瘤细胞杀死。体内实验结果显示GCV可明显抑制MA782 / 5S 810 2 /TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成。实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论　逆转录病毒可介导HSV TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782 / 5S 810 2并获稳定表达 ,HSV TK/GCV自杀基因系统在体内外对乳腺癌细胞均有杀伤作用 ,且存在明显的旁观者效应。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建及体外效应研究

目的 构建高靶向性基因转移及基因表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞的体外杀伤作用。 方法 通过重组DNA技术分别构建anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白表达载体ScFv-GAL4-pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GAL4rec。前者经IPTG诱导表达获取anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白作为非病毒转运载体,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及人肺癌细胞株A549,潮霉素筛选阳性细胞,扩大培养,分别命名为HepG2/tk、SMMC7721/tk及A549/tk,然后通过MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。 结果 双酶切鉴定及SDS-PAGE电泳证明非病毒转移载体anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中,表面TfR阳性且高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;表面TfR阳性但不分泌AFP的A549/tk细胞则对前药不敏感。 结论 双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性。     

CD/5-FC系统对小鼠胃癌细胞杀伤作用的研究

目的：探讨CD5／5－FC自杀基因系统对小鼠胃癌细胞的体外杀伤作用及其机制。方法：以逆转录病毒载体介导CD基因转导小鼠胃癌细胞株MFC,采用MTT法测定CD／5－FC系统的体外杀伤作用及其“旁观者”效应;利用Hoechst 33258荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡细胞,同时采用半定量RT－PCR技术检测凋亡相关基因的表达。结果：转导CD基因可使MFC对5－FC高度敏感,并且显示出强大的“旁观者”效应。经5－FC作用后,荧光染色可见到典型的凋亡细胞核形态学改变,琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA梯度,同时发现凋亡相关基因bcl-2基因表达下调,而bax与caspase-3基因表达上调。结论：CD／5－FC自杀基因系统对小鼠胃癌细胞MFC具有强大的杀伤作用,体外杀伤作用是通过诱导MFC的凋亡来完成。     

慢病毒携带的双自杀基因对淋巴瘤细胞杀伤作用的实验研究

背景与目的:慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫原性低等优点,适于体内基因治疗。本研究探讨慢病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞Raji的杀伤作用。方法:将表达慢病毒的3种质粒,即包装结构基因质粒pCMVΔ8.2、包膜基因质粒pCMV.VSVG、目的基因质粒pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk分两组(pHR'CS.Cdglytk为实验组、pHR'CS.GFP为对照组),经脂质体导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染Raji细胞,用荧光显微镜及RT-PCR检测基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV),用MTT法测定Raji细胞的生长抑制率,检测CD和HSV-tk双自杀基因对Raji细胞的作用。结果:表达慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见富集的病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在Raji细胞中高效、稳定表达。单独使用GCV或5-FC对细胞的生长抑制率分别为51%、50%,与未转染组Raji细胞比较,差异有显著性(P<0.01);联合使用5-FC和GCV对细胞的生长抑制率为73%,明显高于单独使用5-FC或GCV(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染淋巴瘤细胞;双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSVtk/GCV)对淋巴瘤细     

胞嘧啶脱氨酶基因联合5-Fc治疗结肠癌的实验研究

目的研究胞嘧啶脱氨酶基因(CD)联合前体药物5-氟胞嘧啶(5-Fc)对结肠癌细胞的生长抑制作用。方法应用逆转录病毒介导的方法,将逆转录病毒载体pLXSN中含有大肠杆菌CD基因的重组质粒pCD2转染到病毒包装细胞PA317后,感染人结肠癌细胞株SW1116。对转基因的细胞进行RT-PCR检测和体内外药物敏感实验。结果获得了稳定表达EC—CD基因的结肠癌细胞株SWCD2,与野生型SW1116细胞相比,SWCD2细胞对基本无毒性的原药5-Fc的敏感性增加,50％细胞生长抑制率(IC50)浓度由野生型SW1116细胞的16000μmol／L降低到SWCD2的66μmol／L。经5-Fc治疗后,SWCD2细胞的裸鼠移植瘤生长明显缩小。结论CD基因联合5-Fc对人结肠癌细胞具有实验性基因治疗作用。     

HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因对喉癌细胞Hep-2杀伤作用的体外研究

目的:观察自杀基因HSV-tk与不同细胞因子基因(IL-2、TNF-α)构建的不同融合基因表达产物对喉癌细胞系的体外杀伤作用。方法:分别构建不同融合基因逆转录表达载体PL(TI)SN,PL(N)SN,PL(TK)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将各重组病毒分别感染人喉癌细胞系Hep-2,G418筛选出抗性克隆,分别命名为Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK,以RT-PCR及Southern blot检测各融合基因的整合及表达。通过观察各基因修饰细胞生长状况及GCV杀伤实验鉴定融合基因的表达及杀伤效应。结果:RT-PCR及South-ern blot分析证明各重组外源基因在人喉癌细胞系Hep-2中均有整合及表达。Hep/TI,HeP/TK生长速度无明显差别,Hep/TT细胞增殖速度受到抑制。在GCV杀伤试验中,Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK均显示出对GCV的高敏感性,其中GCV对Hep/TT的杀伤作用最为明显,各基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合,均显示出明显旁观者效应。结论:自杀基因与细胞因子基因共表达体系对喉癌细胞系Hep-2体外杀伤具有协同作用,并且有明显的旁观者效应,可望成为肿瘤基因治疗的新途径。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究

目的：构建高靶向性基因转移及表达系统，并研究其介导HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法： 通过重组技术分别构建antiTfR ScFvGAL4融合蛋白表达载体ScFvGAL4pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列（GAL4rec）的HSVtk真核表达载体pEBAF/tkGAL4rec。IPTG诱导后，利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tkGAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2，SMMC7721及A549。潮霉素筛选后，MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果：双酶切鉴定、SDSPAGE电泳及测序分别证明antiTfR ScFvGAL4融合蛋白及重组pEBAF/tkGAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中，高分泌AFP(845 ng/ml) 的HepG2/tk细胞对GCV很敏感，且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关；而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感；不分泌AFP 的A549/tk细胞则不敏感。结论：双靶向组织特异性HSVtk/GCV抗瘤系统构建成功，并显示出很好的靶向性。     

双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用。方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化。将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性。结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强。将K562细胞和K562/CDgly TK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5-FC对瘤细胞的杀伤率。     

缝隙连接蛋白43对双自杀基因系统旁观者效应的影响

Objective： To observe the influence of connexin 43 （Cx43） on the bystander effect induced by cytosine deaminase （CD） and herpes simplex virus thymidine kinase （HSV-tk） coexpression suicide genes system in human cholangiocarcinoma QBC939 cells and transplantation tumors in nude mice. Methods： In vitro, the CD＋tk＋ and CD＋tk＋Cx＋ cells were respectively treated with 5-fluorocytosine （5-Fc） and Ganciclovir （GCV）. The cytotoxic effect was evaluated by MTT method. In order to investigate the influence of Cx43 on the bystander effect, the size of transplantation tumors of the CD＋tk＋ and CD＋tk＋Cx＋ cells was measured before and after application of 5-Fc and GCV. Results： CD and tk genes were stably expressed in transfected QBC939 cells. The increased expression of Cx43 was determined by testing for the presence of Cx43 mRNA by RT-PCR and the presence of Cx43 protein by Western Blot in CD＋tk＋Cx＋ cells. The killing effect of 5-Fc and GCV on CD＋tk＋Cx＋ cells was more effective than that on CD＋tk＋ cells both in vitro and in vivo. Conclusion： Double suicide genes system CD/5-Fc＋tk/GCV could induce remarkable killing effect on cholangiocarcinoma cells in vitro and transplantation tumors in vivo. The cotransfection of Cx43 gene could enhance the bystander effect and hence the inhibition of carcinoma cells.     

HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞体外杀伤效应的研究

目的:研究HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:利用重组DNA技术,将HSV-tk基因亚克隆至逆转录病毒载体(pLNCTK)中,在LipofectAMINE介导下,转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NTH3T3细胞测定病毒滴度,将重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li,G418筛选,直至出现抗性克隆,挑取阳性克隆,扩大培养,命名为MM45T.Li/TK.PCR,RT-PCR对HSV-tk基因修饰的MM45T.Li细胞进行鉴定,然后观察CCV对MM45T.Li/TK和不同比例TK~ 与TK~-混合细胞的杀伤作用.结果:重组逆转录病毒滴度为5×10~5CFU/ml,PCR及RT-PCR分析证明HSV-tk基因已整合至MM45T.Li细胞基因组中,并在mRNA水平上的表达.MM45T.Li/TK与未转基因的原肿瘤细胞,二者的生长速度与形态结构无明显差别.MM45T.Li/TK细胞对CCV高度敏感,即低浓度GCV(1mg/L)处理MM45T.Li/TK细胞3d,即可将其杀死.旁观者效应显示将25%MM45T.Li/TK细胞与75%MM45T.Li混合,发现90%以上的细胞被杀死.结论:小鼠肝癌细胞对HSV-tk/CCV系统高度敏感,并具有明显的旁观者效应.     

Antitumor effects of cytosine deaminase and thymidine kinase fusion suicide gene under the control of mdr1 promoter in mdr1 positive leukemia cells

The multidrug resistance (mdr) mediated by P-glycoprotein (P-gp), the mdr1 gene product, is one of the major obstacles in leukemia treatment. The present study was designed to explore a suicide gene therapy approach targeting mdr1 for reversal of P-gp-mediated mdr in the mdr positive K562/A02 cells. To study targeted killing effects of cytosine deaminase (CD)-thymidine kinase (TK) fusion suicide gene on multi-drug resistant leukemia, the CD-TK fusion suicide gene expression vector driven by mdr1 promoter was constructed and transferred into K562 and K562/A02 cells using lipofectintrade mark 2000. RT-PCR was used to demonstrate that there were CD and TK genes expression in K562/A02 cells, but not in K562 cells. MTT analysis showed that, compared with that in K562/CDTK, the survival rate of K562/A02-CDTK cells decreased and at the same time the apoptotic rate increased after treatment with GCV and 5-FC (P < 0.05). In vivo studies showed that the tumor volume in the prodrug treated K562/A02-CDTK groups was significantly less than that in the NS-control and K562-CDTK groups (P < 0.05). These findings show that the CD and TK fusion suicide gene expression driven by mdr1 promoter is effective in killing multidrug resistant K562/A02 cells.     

自杀基因治疗恶性胶质瘤的研究

目的：单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）基因治疗恶性胶质瘤体内外试验。方法：分子克隆及真核细胞基因转染技术构建逆转录病毒（ＲＶ）载体ｐＭＶ７（ｔｋ）及ＰＡ３１７ｔｋ包装细胞系;体外不同比例混合鼠Ｃ６胶质瘤细胞与ＰＡ３１７ｔｋ细胞,在ＧＣＶ（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）作用下观察细胞存活率;建立ＳＤ大鼠颅内Ｃ６胶质瘤模型（种植５×１０５Ｃ６细胞）,治疗组第３天原位注射５×１０６ＰＡ３１７ｔｋ细胞,５天后腹腔给予ＧＣＶ（３０ｍｇ／ｋｇ．ｄ）,ＭＲＩ全程监测肿瘤消长,观察病症及存活期,并行病理检查。结果：在ＧＣＶ０．１～１０１μｇ／ｍｌ浓度范围内,Ｃ６细胞存活率随ＰＡ３１７ｔｋ细胞混入比例增加而逐渐减低（Ｐ＜０．００１）,并具有ＧＣＶ剂量依赖性（Ｐ＜０．０１）;体内试验治疗组病症轻,生存期延长,ＭＲＩ表明治疗组肿瘤体积较对照组明显减小（Ｐ＜０．０１）,１个月时病理检查见肿瘤细胞消失,代之以小胶质细胞增生并形成坏死囊。结论：应用本实验室构建的ＲＶ载体ｐＭＶ７（ｔｋ）及其ＰＡ３１７ｔｋ包装细胞系治疗恶性胶质瘤是一种有效及具有前途的治疗方法。