骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的以绵羊骨髓间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化（MSC-ECs）作为种子细胞,去细胞猪主动脉瓣为支架,体外三维构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）。方法羊骨髓穿刺液,以Percoll梯度分离液离心法获取骨髓间充质干细胞（MSCs）,在内皮细胞诱导分化液中体外培养、扩增,鉴定;以酶消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,将体外培养扩增的诱导分化后的MSCs种植于支架上,体外三维培养,构建组织工程心脏瓣膜,研究细胞功能及组织学结构。结果MSC-ECs为梭形的成纤维细胞状形态,呈网格状排列;α-SMA、Vimentin、CD-31及Ⅷ因子细胞免疫染色阳性,培养上清液NO及ET-1分别为（165．6±8．9）μmol／L及（50．6±5．6）ng／L,其中NO值明显高于未诱导组（P〈0．05）,猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;诱导分化的MSCs在支架上生长良好,形成完整的细胞层。结论MSCs在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建TEHV。     

人脐静脉内皮细胞用于构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的：以人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)为种子细胞，体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)，并对其分泌纤溶物质——组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)的作用进行观察。方法：获取并扩增HUVECs，种植在猪脱细胞主动脉瓣叶上，体外静态构建TEHV。观察内皮细胞的形态学变化和生长状况。收集瓣膜培养液，采用发色底物法检测瓣膜内皮细胞分泌的t-PA和PAI-1活性。结果：以猪脱细胞主动脉瓣叶作支架，HUVECs做种子细胞，体外成功构建TEHV，种植的HUVECs在瓣膜表面长成一层连续的细胞层，生长状态良好。瓣膜表面的内皮细胞能够分泌纤溶物质t-PA和PAI-1。结论：HUVECs种植在猪脱细胞瓣膜支架上可以构建TEHV，且瓣膜内皮细胞能够分泌t-PA和PAI-1。     

血红素加氧酶-2基因敲除对Fe2+诱导的小鼠脑氧化应激损伤中基底节细胞的保护作用

目的:以人体骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,以去细胞猪主动脉瓣为支架,体外三维构建组织工程心脏瓣膜(TEHV).方法:以胸外科术中切除的肋骨为骨髓来源,采用1.073 g/ml的Percoll梯度分离液离心法获取BMSCs,体外培养扩增、鉴定;以0.05%胰酶 0.02?TA消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,将体外培养扩增的BMSCs种植于支架上,体外三维培养,应力环境下构建TEHV,观察TEHV细胞分泌的一氧化氮(NO)及内皮素(ET-1)水平、免疫组化特征及光镜和电镜下的结构.结果:人BMSCs为梭形,α-SMA及Vimentin染色阳性,CD-31及Ⅷ因子染色阴性,其分泌NO及ET-1分别为(104.1±5.9)μmol/L及(40.9±7.6)ng/L,明显较正常人血管内皮细胞低(P＜0.01);猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;应力条件下体外三维构建的TEHV上活细胞数较静态下构建明显增多(P＜0.01),H-E染色示人BMSCs在支架上生长良好,形成完整的细胞层,扫描电镜示瓣膜表面细胞层完整,细胞呈梭形生长.结论:人BMSCs作为种子细胞已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可作为一种有前途的种子细胞构建自体TEHV;体外三维应力条件下构建TEHV效果明显优于静态培养.     

环氧氯丙烷在组织工程心脏瓣膜构建中对基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶－1（matrix metalloproteinase-1 MMP-1）表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组，用加用3％环氧氯丙烷处理24小时的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓基质干细胞（human bone maiTow derived stroma cells BMSCs）种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve 1EHV），分别行石蜡包埋切片、HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构，并行逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定BMSCs分泌MMP-1的功能。结果BMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好，MMP-1的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架，可以抑制BMSCs的MMP-1表达。     

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究

目的：研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜（TEHV）构建的影响：方法：酶＋去污剂法制备去细胞瓣天然支架，应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP，使GRGDSPC肽与之稳定纳合，然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV文验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣，对照组则为未处理去细胞瓣．体外培养1周后取瓣叶，作苏木精-伊红（H-E）染色和扫描电镜观察，检测羟脯氨酸和DNA含量，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶（LOX）mRNA表达：结果：与对照组比较，实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富，羟脯氨酸和DNA含量值增高，Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强：结论：RGD肽表面修饰去细胞瓣，提高天然支架细胞黏附性，促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌，有利TEHV构建。     

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪-壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪-壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪-壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。     

人骨髓基质干细胞作为心血管瓣膜组织工程种子细胞的实验研究

目的探讨人骨髓基质干细胞（human bone marrow stromal cells，hMSC）作为心脏瓣膜组织工程种子细胞的可行性。方法取胸外科手术患者肋骨骨髓，Ficoll离心法获取单个核细胞，体外培养扩增，以流式细胞仪检测hMSC的表面抗原。将自然分化的hMSC接种于去细胞猪心瓣膜上2周，免疫组化检测细胞分化结果；扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况；生化检测种植细胞DNA含量和细胞外基质，并和隐静脉来源成纤维细胞构建的组织工程瓣膜作对比。结果hMSC在自然条件下能够分化表现成纤维细胞特性，Vimentin和α-SMA染色阳性；电镜观察活性成肌纤维细胞在瓣膜表面生长均匀平滑；瓣膜组织DNA和胶原含量显著高于去细胞瓣组，与成纤维细胞对照组无明显差异。结论hMSC能够在自然条件下先向成纤维细胞分化，并在去细胞猪心瓣膜上增殖生长，分泌胶原，可作为心血管瓣膜组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞和猪去细胞瓣膜支架构建组织工程瓣膜

目的 探讨运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜的方法.方法 体外培养、扩增自体骨髓间充质干细胞并鉴定,接种于以曲拉通-脱氧胆酸钠、RnaseⅠ和DnaseⅠ去细胞的猪心脏瓣膜支架上,形成细胞材料复合物,体外培养7 d,将该复合物移植于裸鼠腹腔,4周后行组织学检测.结果 骨髓间充质干细胞具有与成纤维细胞相似的生物学特性,表达ASMA,Vimentin抗原,去细胞瓣膜去细胞彻底,骨髓间充质干细胞可在支架表面良好生长,形成表面光滑的细胞层,分泌细胞外基质,生长好.在裸鼠体内可继续扩增,形成多层细胞.结论 运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜可生成初级组织工程瓣膜.     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

猪脱细胞主动脉瓣叶不同方法预处理后种植内皮细胞的比较研究

目的:猪脱细胞主动脉瓣叶经不同的方法预处理后,种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs),观察细胞的增殖状态。方法:猪脱细胞主动脉瓣叶分别经纤维连接蛋白(Fn,50 μg/ml)预铺、胎牛血清(FCS)浸泡、无血清DMEM浸泡预处理12 h,采用间隔24 h、3次种植的方法种植 BAECs,于种植后第4天、第7天进行细胞计数,并行MTT法和~3H-TdR掺入量检测比较细胞的增殖状态。同时于第7天取瓣叶进行组织学检测,观察瓣叶表面内皮细胞覆盖情况。结果:种植后第4天和第7天,采用Fn预铺、FCS浸泡预处理的脱细胞瓣叶,其细胞计数、MTT的光密度和~3H-TdR掺入值明显高于无血清DMEM预处理组(P<0.01)。瓣叶经H-E染色,可见Fn预铺、FCS浸泡预处理组内皮细胞的覆盖情况优于无血清DMEM浸泡组。结论:Fn或FCS预处理能明显增加内皮细胞在脱细胞瓣叶表面的黏附和增殖,有利于组织工程心脏瓣膜的体外构建。     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

组织工程心脏瓣膜构建中内皮细胞增殖的影响因素

目的:研究影响种植在脱细胞猪主动脉瓣叶上的新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)增殖的因素。方法:以脱细胞猪主动脉瓣叶为支架,在其上种植BAECs。实验分3组:A组单次种植和多次重复(间隔24 h)种植内皮细胞,细胞总数相同;B组细胞培养液含和不含内皮细胞生长物质(ECGS);C组种植前分别以PBS和 FCS预处理12 h;通过细胞计数,观察种植细胞增殖的变化。结果:多次重复连续种植较单次种植的细胞数明显增加(P<0.05);培养液中加ECGS组细胞计数明显比未加ECGS组高(P<0.05);细胞种植前以FCS浸泡者比以PBS浸泡者细胞数增加(P<0.05)。结论:单独种植内皮细胞于脱细胞猪主动脉瓣叶上时,将瓣叶支架以FCS浸泡,培养液中加ECGS,多次重复、间隔24 h种植细胞能明显促进内皮细胞的增殖。     

直接染色法观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长

为了快速观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长状况，采用去细胞猪主动脉瓣叶为支架，将新生牛主动脉内皮细胞种植于其上，第3、7天取瓣叶行H－E直接染色，并以常规切片H－E染色和扫描电镜作为对照。结果发现，该3种方法观察所见细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步。提示，瓣叶H－E直接染色可方便快捷地观察种植细胞的生长状况。     

动态培养对骨髓间充质干细胞在三维多孔支架中成骨分化的影响

目的  研究动态培养条件下人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中的成骨状况。方法  从人骨髓中分离间充质干细胞进行体外培养扩增,将第3代细胞与多孔β-磷酸三钙支架复合。对细胞/支架复合体进行动态灌注培养（动态培养组）以及静态培养（静态培养组）,28d后采用MTT法检测三维支架中细胞的增殖,通过p-磷酸硝基苯法检测碱性磷酸酶活性,以及应用ELISA方法检测培养过程中骨桥蛋白及骨钙素的分泌。同时对培养后的细胞/支架复合体进行电镜观察及组织学检测,观察人骨髓间充质干细胞形成矿化细胞外基质的能力。结果  培养28d后,动态培养组细胞增殖及ALP活性显著高于静态培养组（P<0.05）。整个培养过程中,动态培养组骨桥蛋白及骨钙素的分泌高于静态培养组。静态培养组中细胞仅在多孔支架周缘增殖,而动态培养组中细胞则在整个支架内增殖。另外,动态培养组支架中形成的组织及新生骨明显多于静态培养组（P<0.05）。结论  动态培养有利于人骨髓来源的间充质干细胞在三维多孔支架中增殖并向成骨方向分化。     

Human vascular smooth muscle cells and endothelial cells cocultured on polyglycolic acid (70/30) scaffold in tissue engineered vascular graft

Background Current prosthetic, small diameter vascular grafts showing poor long term patency rates have led to the pursuit of other biological materials. Biomaterials that successfully integrate into surrounding tissue should match not only the mechanical properties of tissues, but also topography. Polyglycolic acid (70/30) has been used as synthetic grafts to determine whether human vascular smooth muscle cells and endothelial cells attach, survive and secrete endothelin and 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-PGF1α).Methods Endothelial cells and smooth muscle cells were isolated from adult human great saphenous vein. They were seeded on polyglycolic acid scaffold in vitro separately to grow vascular patch (Groups A and B respectively) and cocultured in vitro to grow into vascular patch (Group C). Smooth muscle cells and endothelial cells were identified by immunohistochemical analysis and growth of cells on polyglycolic acid was investigated using scanning electron microscopy. The levels of endothelin and 6-keto-PGF1α in the culturing solutions were examined by radioimmunology to measure endothelial function. Results Seed smooth muscle cells adhered to polyglycolic acid scaffold and over 28 days grew in the interstices to form a uniform cell distribution throughout the scaffold. Then seed endothelial cells formed a complete endothelial layer on the smooth muscle cells. The levels of endothelin and 6-keto-prostaglandin F1 alpha in the culturing solution were (234±29) pg/ml and (428±98) pg/ml respectively in Group C and (196±30) pg/ml and (346±120) pg/ml in Group B; both significantly higher than in Groups A and D (blank control group, all P&lt;0.05 ). Conclusions Cells could be grown successfully on polyglycolic acid and retain functions of secretion. Our next step is to use human saphenous vein smooth muscle cells and endothelial cells to grow tubular vascular grafts in vitro.     

聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管

目的：探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯（PLGA）降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管（TEBV）的可行性。方法：将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能。结果：培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好。结论：应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性。     

骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞Angiogenin1，Angiogenin2基因的表达

目的：研究骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞表达成熟血管内皮细胞特异性基因,探讨为组织工程血管化提供种子细胞的可行性．方法：从SD大鼠后肢获取骨髓基质干细胞,进行体外扩增培养,取生长良好的第3代细胞体外诱导培养14d．细胞分诱导组（含内皮诱导因子VEGF和bFGF的完全血管内皮细胞条件培养基）和对照组（含M199普通培养基）．MTT法检测两组细胞增殖活性．免疫细胞化学法检测CD31,CD34蛋白的表达;RT—PCR检测细胞血管生成素1（Ang1）、血管生成素2（angiogenin2,Ang2）mRNA的表达．结果：MTT法检测发现,诱导组与对照组在1,2,3,4,5d5个时间点内,其细胞增殖活性无显著性差异（P1d=0．855,P2d=0．053,P3d=0．249,P4d=0．059,P5d=0．174）．免疫细胞化学检测结果CD34,CD31呈阳性表达．RT—PCR结果显示,诱导的血管内皮细胞表达成熟内皮细胞特异性基因Ang1,Ang2．结论：骨髓基质干细胞在一定诱导条件下可以表达血管内皮细胞特异性标志,可作为组织工程血管化理想的种子细胞．