斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达

目的探讨Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌中表达的时相变化.方法收集不同发育时期的AB野生型斑马鱼胚胎,采用整体原位杂交技术检测Mef2c在骨骼肌和心肌的转录情况.结果Mef2c在体节中的表达约在13 hpf,而在心脏中的表达出现在13 hpf以后,与体节中的表达时间基本平行.另外,Mef2c在体节和心脏中的表达一直维持到48 hpf.结论明确了Mef2c在斑马鱼胚胎骨骼肌和心肌发育的表达时相变化,为研究斑马鱼早期骨骼肌和心肌发育的调控机制提供了一定的理论基础.     

Polycomb家族基因Nspcl在斑马鱼早期发育的表达

目的 探讨Polycomb家族基因Nspel在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式.方法 根据GenBank中斑马鱼Nspcl的cDNA序列设计Nspcl原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针.收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果.结果 在斑马鱼体节期前,Nspcl在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达.结论 Nspcl在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色.     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

Polycomb家族基因Nspc1在斑马鱼早期发育的表达

目的探讨Polycomb家族基因Nspc1在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式。方法根据GenBank中斑马鱼Nspc1的cDNA序列设计Nspc1原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针。收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果。结果在斑马鱼体节期前,Nspc1在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达。结论Nspc1在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色。     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

斑马鱼mcm5基因的表达分析及在体节发生中的功能

目的细胞周期因子MCM5在DNA复制起始中起着关键性作用,并参与基因转录调控,但其在胚胎发育中的作用鲜有报道。本文首先研究mcm5在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,然后对mcm5在斑马鱼体节发生中的作用进行研究。方法通过原位杂交的方法分析mcm5在斑马鱼发育早期的表达谱,然后运用MO注射的方法敲降mcm5功能,并结合原位杂交的方法分析mcm5在体节发生中的作用。结果整胚原位杂交实验显示,MCM5为母源性因子。在胚胎1细胞期到体节发生早期,mcm5呈广泛表达;从胚胎发育4体节开始,mcm5开始在尾牙、体节、头部区域呈现特异性表达,暗示其可能参与了体节发生的调控。在mcm5功能敲降时,活体胚胎除体轴变短、眼睛变小以外无明显畸形。但原位杂交实验显示体节发生相关标记性基因表达减弱,表明mcm5可能参与了体节发生的调控。结论在斑马鱼早期发育中mcm5参与了体节发生的调控。     

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

胰岛素样生长因子结合蛋白-2参与斑马鱼胚胎心血管系统发育的实验研究

 目的 通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸制作斑马鱼IGFBP-2基因表达下调的动物模型,观察IGFBP-2表达下调导致斑马鱼胚胎心脏血管发育的异常表型及其对心脏发育相关基因表达的影响。方法 胚胎整体原位杂交验证IGFBP-2基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。特异抑制IGFBP-2基因启动子的吗啡啉（morpholino,MO）和标准对照吗啡啉（Con-MO）由Gene-Tools公司设计合成。设置0.05、0.10、0.25和1.0 mmol/L 4个不同浓度梯度的IGFBP-2 MO注射组,观察不同注射浓度对斑马鱼胚胎心脏异常表型发生率和死亡率的影响,并与Con-MO注射组以及野生型（Wild type,Wt）对照组比较。详细记录0.25 mmol/L浓度 IGFBP-2 MO注射组不同发育时段斑马鱼胚胎心脏发育的异常表型。荧光显微镜下观察IGFBP-2 EGFP重组质粒单独以及与IGFBP-2 MO或Con-MO共注射后12hpf胚胎的绿色荧光表达。原位杂交比较IGFBP-2 MO注射组与Wt组斑马鱼心房标记基因Amhc的表达情况;观察IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异性绿色荧光的变化;显微血管荧光造影显示IGFBP-2 MO注射组与Wt组胚胎外周血管发育的差异。结果 斑马鱼胚胎早期的发育过程中,IGFBP-2基因在眼球、中脑和肝脏先后表达。0.25 mmol/L浓度MO注射组12 hpf存活的胚胎在48 hpf有59.6%发生心脏发育的异常表型,包括心管搏动无力、心包水肿和房室环化障碍,部分胚胎发生心房扩大、房室反流伴循环瘀滞,且畸形随发育时间推移加重。接受单独显微注射IGFBP-2 EGFP重组质粒和与Con-MO共同注射的Wt胚胎12 hpf出现明显的绿色荧光表达,而重组质粒与IGFBP-2 MO共同注射的胚胎几乎无荧光表达,证实MO下调斑马鱼胚胎IGFBP-2基因的有效性。48 hpf胚胎整体原位杂交显示IGFBP-2 MO注射组心房特异标记基因Amhc的表达下调;48 hpf IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异绿色荧光蛋白的表达减弱;60 hpf IGFBP-2 MO注射组显微血管荧光造影显示体节间血管显影稀疏紊乱。结论 显微注射IGFBP-2 MO能够有效实现斑马鱼胚胎的IGFBP-2基因下调。IGFBP-2基因下调导致斑马鱼胚胎心脏血管的异常表型,并抑制心脏发生基因Amhc和Vmhc的表达。IGFBP-2在斑马鱼胚胎心血管系统的正常发育过程中起到重要作用。     

斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的 探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法 利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果 生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48～96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论 斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性...     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

[摘要]：目的 构建斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,经体外转录合成斑马鱼pax5基因的反义mRNA探针。方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。结果 采用RT-PCR和pCS2+载体等相关技术获得了斑马鱼pax5基因克隆,经酶切、菌落PCR以及测序鉴定证明得到了pCS2+-pax5重组质粒以及pax5基因的反义mRNA探针,经过斑马鱼全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况。结论 成功构建了pCS2+-pax5重组质粒、制备了pax5基因的反义mRNA探针以及完成了野生型斑马鱼不同时相的全胚胎原位杂交。     

斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定

目的 由于原肠期细胞的剧烈运动,在斑马鱼胚胎的背侧汇聚形成了称为胚盾（Shield Organizer）的结构,是胚胎发育的信号组织中心,在背腹轴建立和胚层诱导过程中具有关键作用。系统鉴定在胚盾特异表达的基因,可为进一步探讨胚盾形成的机制及其指导胚胎早期发育的分子机理提供参考。方法 Tg(gsc:GFP)转基因鱼在胚盾表达特异的绿色荧光。通过流式细胞分选技术分离富集GFP阳性细胞并提取总RNA进行RNA深度测序,检测可能在胚盾高水平表达的基因。然后利用荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和原位杂交技术鉴定若干在胚盾特异表达的基因。结果 从Tg(gsc:GFP)转基因鱼胚胎中分离富集到了纯度超过96%的GFP阳性细胞,RNA深度测序的结果显示有657个基因的表达水平比整胚细胞或GFP阴性细胞高2倍以上。最后,确认了KIAA1324,ripply1,twist2,isthmin1,nme4,zgc174153,rrbp1b等7个基因在胚盾特异表达。结论 系统鉴定到了斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因,为下一步研究这些基因的发育生物学功能奠定了基础。     

Clec14a基因调控斑马鱼胚胎血管发育*

目的：探索Clec14a在斑马鱼胚胎期的表达及其在血管发育过程中的功能,探讨该基因调控血管发育机制。方法：通过胚胎整体原位杂交技术,观察Clec14a基因在斑马鱼胚胎期的表达情况;在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）和Tg（fli1a:nGFP）中,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸（morpholinoantisense oligos）下调Clec14a基因表达,同时在转基因斑马鱼系Tg（kdrl:mCherry）中注射Clec14a-mRNA调控Clec14a基因表达,利用激光共聚焦显微镜观察分析斑马鱼节间血管（intersegment vessel,ISV）表型,统计分析内皮细胞迁移速度和数目的变化,并应用qRT-PCR技术检测下调后该基因mRNA表达情况。结果：在受精后24 h、48 h和72 h,Clec14a基因在斑马鱼脑、心脏、血管系统中有表达;Clec14a基因表达下调导致ISV发育缺陷,内皮细胞数目减少,抑制其迁移速度。结论：下调Clec14a基因表达能够通过抑制内皮细胞增殖和内皮细胞迁移调控斑马鱼胚胎血管发育。     

过表达BAFF转基因斑马鱼的构建

目的体外克隆斑马鱼baff基因并分别构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒,通过胚胎显微注射获得过表达baff的转基因斑马鱼,以探讨其作为人类SLE模型和用于SLE药物筛选的意义。方法通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆出斑马鱼baff基因全长807 bp蛋白编码区域,分别构建baff过表达载体pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff及pIRES2-EGFP-baff重组质粒,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达后,通过胚胎显微注射过表达载体,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼。结果通过体外细胞转染实验与免疫印迹法验证了pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff转染后细胞Baff-GFP融合蛋白的成功表达,通过胚胎显微注射与GFP荧光筛选,成功获得过表达baff的转基因斑马鱼。结论本研究所构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒均可通过显微注射获得过表达baff的阳性转基因斑马鱼,为进一步探讨其作为人类SLE疾病模型的意义及Baff拮抗药物的筛选奠定基础。     

Daxx在斑马鱼胚胎发育中的作用及其机制研究

目的明确死亡结构域相关蛋白（Daxx）在斑马鱼胚胎发育过程中的时-空表达谱,并研究其作用与机制。方法利用原位杂交技术检测Daxx的表达谱;利用吗啉反义寡核苷酸介导的基因敲减技术敲低Daxx的表达,观测斑马鱼胚胎发育情况,并用pH3和TUNEL染色检测Daxx敲低后细胞增殖及凋亡的改变;通过Real—TimePCR实验研究Daxx影响细胞凋亡和胚胎发育的分子机制。结果敲低Daxx后斑马鱼胚胎细胞凋亡和畸形率显著增加,这一表型能被p53蛋白共敲低所恢复;在分子机制上,Daxx敲低可不同程度特异性激活bax、mdm2、p21和cyclinG1等p53下游多个基因的表达,Daxx富含酸性氨基酸的功能区介导rjj述过程。结论Daxx利用其自身结构域与p53作用,并特异调控其下游关键基因的表达,参与调节斑马鱼胚胎细胞凋亡和形念发育。