真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12（MAGE-12）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE—12，并在真核细胞中表达。方法于2005—10～2005—12对郑州大学第一附属医院应用RT—PCR方法．从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段，经过酶切鉴定后，克隆至质粒载体（pGEM—Teasy），测序证实碱基序列无误后，再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP—C3）上，并转染真核细胞，观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证，PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12，该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12，为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

B7-1转基因骨肉瘤疫苗的制备及鉴定

目的构建含B7—1基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体,转染LM8骨肉瘤细胞制备骨肉瘤疫苗。方法用RT—PCR法扩增B7—1基因片断,应用含GFP基因的真核表达质粒构建融合表达载体,酶切、测序鉴定构建质粒;采用脂质体介导方法将其转染到LM8细胞,并用荧光显微镜及LCM结合蛋白免疫印记检测其在肿瘤疫苗细胞中的表达。结果经PCR及酶切鉴定,证实成功构建了含B7—1基因的真核表达重组体pEGFP—C1／B7,重组子测序结果与国际基因文库中mB7—1序列相符。用荧光显微镜观察到疫苗细胞中有GFP表达,RT—PCR检测到疫苗细胞中B7—1基因的表达．westernblot发现疫苗细胞中有B7蛋白的表达。结论B7—1重组真核绿色荧光表达载体pEGFP—C1／B7已成功构建,转染,LM8细胞成功制备了骨肉瘤细胞疫苗。     

旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达

目的构建和表达旋毛虫重组质粒。方法PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒。采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞。分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠。结果和结论成功构建pcD-NA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达。     

pEGFP?N1?HBsAg?ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定

目的 构建pEGFP?N1?HBsAg?ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础。 方法 根据HBsAg基因序列和pcDNA3?p30?ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBsAg基因,经酶切、连接、转化,利用HBsAg基因替换p30基因,构建pcDNA3?HBsAg?ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBsAg?ROP2片段与pEGFP?N1真核表达载体相连,构建pEGFP?N1?HBsAg?ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平。结果 HBsAg片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pcDNA3?HBsAg?ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符。pEGFP?N1?HBsAg?ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与GenBank发表的序列同源性为99.84%。目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml。结论 成功构建pEGFP? N1?HBsAg?ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达。     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

肝片吸虫GST真核表达载体构建及重组蛋白活性分析

目的构建肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶（GST）的真核表达载体,研究重组蛋白的免疫原性。方法以构建好的重组质粒pET30a-FhGST为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因（GST）,连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-GST,转染Hela细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况。结果重组质粒pEGFP-GST在Hela细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应。结论肝片吸虫GST真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有生物学活性,可做为分子疫苗的候选进行进一步的研究。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因Urel的真核载体构建、表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H．pylori）尿素通道蛋白编码基因（UreI）的真核表达的重组载体,并在COS-7细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法以原核表达质粒pET32a（＋）／UreI为模板,扩增UreI编码基因片段,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pEGFPN1进行连接,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pEG—FP—N1／UreI,并在COS-7细胞中表达,以荧光蛋白和Westernblot法检测其表达产物。结果经酶切、测序证实插入的基因片段为H．pyloriUreI蛋白编码基因;荧光显微镜下和Westernblot法等检测显示,该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白,同时能够被H．pylori阳性患者血清所识别。结论成功地构建了真核重组载体pEGFP—N1／UreI,并在COS-7细胞中表达。     

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达,为其临床应用奠定基础。方法以RT—PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP—N1中构建质粒pEGFP—CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导人肺腺癌A549细胞中,加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞,并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP—CCR7构建正确,荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株;本研究为临床应用提供了实验依据。     

pEGFP—P21真核表达载体构建及在AGS细胞的表达定位

目的：构建人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（cyclin2dependent kinase inhibitor）P21^WAF基因的真核表达载体pEGFP—P21，建立稳定表达P21蛋白与pEGFP 融合蛋白的AGS细胞系，，为进一步研究P21对下游基因的调节作用提供实验基础。方法：用PCR法在pCDNA3-P21质粒中定向插入EcoR1、BarnH1酶切位点，扩增P21 cDNA；采用亚克隆技术构建绿色荧光蛋白pEGFP—C2-P21融合基因表达载体；PCR法、双酶切及测序鉴定。脂质体转染试剂将重组载体转染人胃癌AGS细胞系，G418筛选20天挑取表达pEGFP-P21的抗性克隆扩大培养、传代。荧光显微镜直接观察pEGFP—p21在细胞中的分布和定位，流式细胞术分析细胞周期。结果：鉴定结果表明重构载体pEGFP-P21序列和方向正确，借助绿色荧光蛋白直观观察P21定位于AGS细胞核。细胞周期分析细胞阻滞与G1／S期。结论：成功建立稳定表达pEGFP—P21的AGS细胞株，P21在细胞核内发挥周期阻滞的作用，P21对细胞周期的影响可能为其调节其他因子是始动因素，为进一步研究P21基因的功能奠定了实验基础。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12(MAGE-12)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,并在真核细胞中表达。方法于2005-10～2005-12对郑州大学第一附属医院应用RT-PCR方法,从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至质粒载体(pGEM-Teasy),测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI的真核载体构建、表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(UreI)的真核表达的重组载体,并在COS-7细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法以原核表达质粒pET32a(+)/UreI为模板,扩增UreI编码基因片段,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pEGFP-N1进行连接,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pEG-FP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达,以荧光蛋白和Western blot法检测其表达产物。结果经酶切、测序证实插入的基因片段为H.pyloriUreI蛋白编码基因;荧光显微镜下和Western blot法等检测显示,该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白,同时能够被H.pylori阳性患者血清所识别。结论成功地构建了真核重组载体pEGFP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达。     

弓形虫主要表面抗原1单链抗体与绿色荧光蛋白的融合表达及其生物活性初步观察

目的 构建、表达和纯化刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）主要表面抗原1（SAG1）单链抗体S1与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，体外观察其与弓形虫速殖子的特异性结合能力。 方法 分别设计引物，构建原核表达质粒pET-26b-GFP和pET-26b-GFPS1，测序验证后转化大肠埃希菌BL21（DE3），以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导表达，荧光显微镜观察融合基因中GFP的表达情况。用Ni²⁺螯合柱亲和纯化融合蛋白GFPS1，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测融合蛋白GFPS1。荧光显微镜观察融合蛋白GFPS1与弓形虫速殖子体外孵育后单链抗体S1对弓形虫速殖子的靶向作用。 结果 测序结果显示，弓形虫SAG1单链抗体S1与GFP的融合基因构建到原核表达载体pET-26b（+）中；IPTG诱导表达后，在荧光显微镜下可观察到E.coli BL21发出的特异性绿色荧光。SDS-PAGE检测到表达的融合蛋白GFPS1相对分子质量（Mr）约为53 000，多以包涵体形式存在。免疫荧光检测可见弓形虫速殖子表膜周围发出特异性的绿色荧光，表明纯化的GFPS1可特异性地结合到弓形虫速殖子表膜。 结论 弓形虫主要表面抗原1（SAG1）单链抗体S1与弓形虫速殖子表膜有较强的结合能力。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的 进行弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合基因的克隆与表达，为弓形虫ROP2?鄄P30基因工程复合抗原的制备做准备。 方法 半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段，克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中，经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上，鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus（DE3）-RIL，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段，成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30，该质粒经PCR和酶切鉴定，与预期结果一致，并在大肠埃希菌中高效表达，产生相对分子质量（Mr）约为 69 000的重组目的蛋白。 结论 弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功，并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。     

原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．     

日本血吸虫新基因Sj Dad1的DNA免疫动物保护性实验研究

目的　观察日本血吸虫未知基因SjDad1的DNA免疫保护动物实验效果 ,探讨其作为疫苗候选分子的可能性。方法　构建SjDad1的真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1,两次质粒DNA免疫BALB/c小鼠后给予小鼠日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,设置生理盐水对照组 (NS)和pEGFP -N3 对照组 ,攻击感染后 4 2天处死小鼠 ,计算减虫率和减卵率。结果　双酶切和PCR反应以及测序结果证实重组真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1构建成功 ,DNA免疫动物的保护实验证明 pEGFP -N3 -SjDad1与生理盐水组相比对小鼠没有显著的减虫作用 (P >0 0 5 ) ,减卵效果具有显著性意义 (P <0 0 1) ,减卵率是6 5 74 %。结论　日本血吸虫 pEGFP -N3 -SjDad1有抗血吸虫生殖作用 ,具有疫苗研究开发价值。     

人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH,并观察其转染单核巨噬细胞株U937后,细胞中hCEH的表达情况。方法以人肝细胞L-O2总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hCEH编码区序列,将扩增片段插入到pMD19-T载体中,回收、纯化目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体上,经双酶切、测序鉴定后,转染U937,观察U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT-PCR扩增hCEH基因的编码区序列获得1条约1.7 kb的片段,与预期片段大小相符;以pEGFP-N1为载体,成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-hCEH,该质粒可以在U937中表达。结论成功构建pEGFP-N1-hCEH,用其转染U937后,细胞中pEGFP-N1-hCEH大量表达。     

重组质粒PcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B在Hela细胞中表达的研究

目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行 SDS-PAGE 和 Westem-Blot 分析,检测融合蛋白的免疫学活性。结果经重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 稳定转染的 Hela 细胞表达了分子量约64KD 的融合蛋白,经 Western-Blot 检测证实该融合蛋白具有 P30免疫原性。结论在HeLa 细胞中成功表达了具有 P30免疫原性的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B,为下一步动物实验奠定了基础。     

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;Westernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。