SARS疫苗研究进展

严重急性呼吸综合征（SARS）是由SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）引起的一种新的传染病。虽然SARS的流行已经被有效控制，但很可能因实验室样本外泄或动物宿主中由类SARS-CoV演化而来的病毒的分离株导致再次爆发，阻止SARS再次流行最有效的方法就是研制安全有效的疫苗，所以，SAILS疫苗的研究仍然是目前SARS相关研究的重点。不同类型SARS疫苗的研究已经迅速展开，并且有些疫苗研究已取得了突破性的进展，进入了临床试验阶段。但在SARS疫苗的研究过程中也遇到了很多问题，如抗体依赖性感染增强（ADE）、SAILS-CoV病毒变异快、没有理想的动物模型等。本文对SARS疫苗的研究、疫苗研究中存在的问题等进行了综述。     

SARS病原体特征与临床实验室诊断

SARS的全球性流行带来了严重的公共卫生问题和社会经济问题.目前,在SARS病原体鉴定、基因组结构和序列变异、SARS流行特征和实验室诊断等方面获得了很大的进展.现已证实SARS的病原体为SARS冠状病毒.SARS冠状病毒是一种与原来已知冠状病毒在某些方面类似、但又独具特征的新型冠状病毒,该病毒的起源可能源于野生动物.多个SARS冠状病毒的全基因组核酸序列测定现已完成,在SARS冠状病毒的实验室诊断方面,现已有了免疫学方法检查抗体和分子生物学方法检查病毒RNA.直接检测病毒抗原和定量检测病毒多靶点基因是今后的发展方向.     

一种新型冠状病毒基因的克隆和序列分析与传染性非典型肺炎病原学的调查

目的 探讨冠状病毒感染与传染性非典型肺炎发病的关系，分析冠状病毒基因序列变异的临床意义，建立诊断冠状病毒变异株感染的分子生物学方法。方法 收集非典型肺炎(SARS)患者的不同临床标本，采用PCR技术分别进行衣原体、甲肺炎病毒以及冠状病毒等的基因检测。以冠状病毒相对保守的依赖RNA的RNA多聚酶基因为靶基因，采用Nested RT—PCR技术从非典型肺炎患者的鼻咽吸取物标本和濑喉液标本中扩增出冠状病毒基因，将PCR产物直接克隆到T载体，进行序列测定，进一步比较不同分离株间的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果 在27例非典型肺炎患者中检出冠状病毒基因阳性6例，阳性率为22．2％。而在15例健康对照中，全部阴性。采用BLAST软件将所获得的冠状病毒的基因序列与基因库(GenBank)登记的序列比较，结果显示本次分离克隆的冠状病毒基因与既往报道的所有冠状病毒在核苷酸水平没有相关性，核苷酸同源性最高不超过40％。但在氨基酸水平的同源性为80％左右(70％-82％)。从不同患者中分离的冠状病毒基因之间在核苷酸水平的同源性在98％以上。与刚刚公布的加拿大、中国香港、英国等SARS冠状病毒的核苷酸序列同源性在99％以上。结论 相当部分非典型肺炎患者存在冠状病毒的感染，提示本次的非典型肺炎发病与感染冠状病毒有关。序列分析结果表明从本次非典型肺炎患者中分离的冠状病毒为一种新的冠状病毒，并与世界其他地区分离的SARS冠状病毒同源性达99％以上。以RNA多聚酶为靶基因Nested RT—PCR技术可以用于诊断这一新种冠状病毒感染。     

SARS病毒S1蛋白的克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

目的：研究SARS病毒感染后机体产生保护性免疫应答的规律和可能机制。方法：通过生物信息学分析，在原核表达系统中表达了SARS病毒S1蛋白。利用SARS流行前正常人血清和6份SARS患者恢复期的血清，对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析。结果：研究中克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白的序列相同。6份SARS患者恢复期的血清均能识别重组S1蛋白，而6份SABS流行前的正常人血清则不能与重组蛋白反应。结论：获得的重组S1蛋白具有与天然SARS病毒s1蛋白相同的序列，并具有与之相似的血清学反应性，为研究SARS病毒感染免疫应答的过程及其机制和制备SARS病毒的重组疫苗提供了良好的物质基础。     

广东省SARS流行株M基因序列分析

目的：测定广东省不同流行时期13份SARS病毒(SARS CoV)标本的M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒在流行过程中是否发生了变异。方法：提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR，将产物纯化后直接测定核苷酸序列。结果：13份标本M基因核苷酸序列同源性很高，为99．7％～100％，M基因核苷酸序列只在2个位点(80和203位)发生变异，1株80位点的变化引起编码的氨基酸从苯丙氨酸(F)变为半胱氨酸(C)，3株203位变化为无义突变。结论：M基因核苷酸序列变异不大，初期和后期M基因核苷酸序列与流行高峰期的毒株相差1个碱基，但氨基酸序列相同；从香港感染病人分离的1株病毒M基因与广东本地感染分离株存在1个氨基酸的差异。     

一例输入性非典型肺炎患者病原体的分离鉴定及其变异性研究

目的 对一例输入性非典型肺炎病例的病原体进行分离鉴定，研究其变异情况，为该病的诊断和防治提供依据。方法 用Vero E6细胞对病人的咽拭标本进行分离培养，并对分离物使用电镜、间接免疫荧光(IFA)、巢式PCR及S基因核苷酸序列测定等方法进行分析。结果 在该病人的咽拭标本中，成功地分离到一株冠状病毒(R69)，将部分S基因测序并与不同地区非典型肺炎病人分离株进行比较，表明分离到的毒株为一种新型冠状病毒。结论 目前存在冠状病毒的变异株，病毒核苷酸序列与广东省原发性SABS病人分离到的冠状病毒有所不同。     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

严重急性呼吸综合征相关冠状病毒检测探针制备及组织原位杂交

严重急性呼吸道综合征(SARS)的流行暴发引起了世界范围内对SARS病原体的分离及发病机制的研究。国内外多个研究机构报道一种新型的冠状病毒为SARS的致病因子；于部分患者的血液、呼吸道分泌物，粪便中检测到这种病毒的存在，或血清中具有该病毒的抗体产生。这对SARS的诊断和治疗都具有重要的意义。但直接于患者的病变组织中检测SARS病毒的报道较少。我们尝试从病变组织中检测SAPS病毒。     

广东地区严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清的IFA检测

目的：证实新分离出的冠状病毒与SARS患者的关糸。方法：应用IFA诊断试剂做免疫荧光染色，检测2003-02-04-04-13期间，广东地区3所医院临床诊断为SARS的72例患者血清特异性抗体，以及直接参加救治SARS患者但末发生感染的109名医护人员的血清标本，并以疾病流行期间70例健康体检者作为正常对照组。结果：72例SARS患者中，62例血清特异性：IgG呈阳性；而109例密切接触但末发生感染的医护人员及70例SARS流行期间健康体检者，血清特异性IgG和IgM均呈阴性。结论：SARS冠状病毒是引发广东地区SARS的病原体。     

一种SARS冠状病毒诊断基因芯片的研制

通过筛选SARS冠状病毒的基因序列，获得其有效检测的基因位点；利用已有的基因芯片技术，研制了一张用于SARS冠状病毒诊断的基因芯片。经临床标本检测验证，该基因芯片的粗符合率达到94．29％；检测灵敏度达到10^-2／ml病毒分子，具有很好的实用性。     

广东省严重急性呼吸综合征病毒的分离和鉴定

目的 分离和鉴定引起广东省非典型肺炎的病原体。方法 收集非典型肺炎患者的各种临床标本，用狗肾传代细胞(MDCK)进行病原体分离，并运用血清学和分子生物学方法进行鉴定。结果 用MDCK细胞从非典型性肺炎患者标本中分离到病毒，用SARS病毒聚合酶基因的特异引物，通过巢式聚合酶链反应(nest RT-PCR)，扩增出一个279nt的片段，序列分析结果显示，该序列和目前已知的冠状病毒有39％-65％同源性，和来源于不同地区分离的SARS冠状病毒株(中国北京、香港、台湾和德国、意大利等)在同一个位置(第12个碱基)仅有一个碱基不同，由a→t。间接免疫荧光抗体检测显示，该病毒能够和非典型肺炎患者的恢复期血清呈特异的抗体反应。结论 这种新的冠状病毒是引起广东省非典型肺炎的病原，且能够用MDCK细胞进行分离。     

SARS冠状病毒核壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)核壳(N)蛋白单克隆抗体,为寻求SARS早期诊断的方法及深入研究SARS疾病提供有力的工具。方法以重组SARS—CoVN蛋白免疫小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法制备单克隆抗体。通过间接酶联免疫分析、间接免疫荧光、免疫双向扩散等方法鉴定抗体的特异性、亲和力、类型及亚类、配对效果等。结果共获得15个阳性克隆,其中10个与天然SARS-CoV呈阳性反应。10株单抗的相对亲和常数在108～109mol／L^-1之间;10株中有1株为IgG2b。、1株为IgG3,其余均为IgG1;10株单抗中有8株与12种肺炎相关的病原体无交叉反应,1株与流感病毒A、B,副流感病毒有交叉反应,1株与流感病毒A、B有交叉反应;10株单抗中的5株可形成5种配对,其中两种配对用于检测重组SARS病毒N蛋白,灵敏度可达1μg/L。结论获得了特异性针对SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测SARS-CoVN蛋白的酶联双抗体夹心法,为SARS的早期诊断、蛋白质组学的研究奠定了基础。     

从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组序列特征研究

目的通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了从脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）全基因组序列特征,以了解其致病性的分子基础。方法采用RT．PCR法和核酸序列测定法获得病毒基因组全序列,并利用DNASTAR、ClustalX version2．0．9及MEGAversion4．1等生物学软件分析该乙型脑炎病毒核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化等。结果研究结果表明从病毒性脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）基因组全长为10965nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示GZ56株全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因I型乙脑病毒（M-28株）处于同一进化分支。GZ56株与其他基因I型乙脑病毒核昔酸和氨基酸序列同源性分别为96．2％～98．6％和98．2％～99．7％。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。结论本研究提示,从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组未见明显变化,从基因组水平可以推测该病毒可以被现行的乙脑疫苗所保护。     

微生物学

日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用；HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装；SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达；肠出血性大肠杆菌O157：H7紧密黏附素免疫保护性片段的基因克隆与表达；甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学调查；一株西尼罗病毒株的生物学特征研究；JC病毒样颗粒可直接转运进人细胞核；我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达；甲肝减毒活疫苗L-A-1疫苗株的核酸序列测定与比较分析；河南省分离的HIV-1B-Thai亚型流行株全基因组克隆及序列分析；HCV抗体检测试剂对血站HCV抗体初筛试剂的评价；巨细胞病毒感染后晚期mRNA表达与细胞病变相关性的研究；狂犬病北京3aG-V生产株的特性研究；丙型肝炎病毒NS5a高免疫原区人工合成多肽抗原性的研究；反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究；逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究；MMP-2、MT-MMP-2在实验性肝纤维化形成和逆转过程中表达的动态研究；北京地区2株人偏肺病毒的P和M蛋白基因序列分析；丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原异质性分析；人УδT细胞TCR分子与结核杆菌多肽抗原特异性结合的证据；霍乱弧菌减毒活疫苗候选株IEM109的构建；问号钩端螺旋体内化过程中细胞内游离Ca^2＋水平变化及细胞凋亡；黏膜免疫戊型肝炎试验性疫苗的研究；表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究；O157：H7原噬菌体消除菌株的鉴定与分析；结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL的表达及鉴定；钩端螺旋体OmpL1抗原表位预测、克隆和表达；重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和序列分析；结核分枝杆菌Rv1884基因的克隆、表达及亲和层析纯化；羊瘙痒因子263K经多种途径感染仓鼠的脑外组织PrP^Sc分子和沉积特点研究；流感病毒血凝素基因HA1区的克隆及其真核表达载体的构建；分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定；5-氟胞嘧啶耐药白色念珠菌的DNA与RNA的随机扩增多态性分析；通用引物检测儿童血和脑脊液的6种疱疹类病毒；人类免疫缺陷病毒1型RNA定量参考品的研制；广东2003年末SARS患者冠状病毒抗原抗体动态特征分析。     

SARS-CoV、229E和OC43的抗原相关性研究

目的：分析SARS冠状病毒（SARS—CoV）和人冠状病毒（229E和OCA3）的抗原相关性。方法：制备三株冠状病毒的免疫兔血清及其重组核衣壳（N）蛋白的免疫小鼠血清，分别采用SARS法、Western blot和免疫荧光法对免疫血清进行检测以分析三株冠状病毒的抗原相关性。结果：Westem blot结果显示重组N蛋白免疫小鼠血清仅与各自的冠状病毒或重组N蛋白有特异性反应，相互间无交叉反应，而SARS结果显示OC43重组N蛋白免疫小鼠血清与SARS—CoV、229E N蛋白出现了构象抗体的交叉反应。同时，免疫荧光结果显示SARS—CoV和OCA3免疫兔血清与229E感染细胞存在较明显的交叉反应，但在SARS、Westem blot结果中全病毒免疫兔血清均仅与各自N蛋白特异性反应，相互间无交叉反应。结论：SARS—CoV、229E和OCA3N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应，而SARS—CoV、OC43全病毒免疫血清均和229E出现明显的交叉反应。另外，基因重组的OCA3 N蛋白与另外二种N蛋白出现重组构形表位的交叉反应，提示以基因重组的蛋白作为诊断试剂，可能会因为蛋白的空间构象发生改变而产生非特异性反应。     

SARS冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其活性测定

严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）病原体是SARS冠状病毒（SARSCoV）,研究开发安全有效的SARS-CoV疫苗以控制SARS成为热点.经过对12株SARS冠状病毒基因序列比较,发现S蛋白的氨基酸突变率仅为0.23%,其较高的保守性为疫苗研究奠定了良好的基础,由此,S蛋白成为候选疫苗的重要靶位.pcDNA3.1（＋）是一种高效率的质粒型真核表达载体.本研究将SARS-CoV的S1基因片段连至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建重组pcDNA3.1（＋）/S1并初步研究其免疫效果.     

SARS冠状病毒抗体工程的研究、应用及进展

SARS冠状病毒（SARS-CoV）抗体工程的研究建立了SARS的快速检测方法，深入探索了病毒的传播途径及致病机理。人源化抗体的研制及动物试验的成功使单克隆抗体用于SARS-CoV的预防及治疗成为可能。     

乙型肝炎病毒D基因型系统进化树分析

目的：研究HBV D基因型不同毒株全基因进化关系。方法：用聚合酶链式反应（PCR）、克隆及核酸序列测定的方法，测定了1例中国人慢性无症状携带者感染的乙型肝炎病毒D基因型全基因序列。此D基因型毒株全基因序列GenBank Accession为AF280817，将GenBank中已发表的HBV D基因型30株的全序列进行了系统进化树分析。结果：中国株HBV D基因型与源于瑞典（Sweden）的4株HBV D基因型全基因的进化距离最近；地中海地区及欧洲国家系HBV D基因型分布的优势地域，亚洲并非HBV D基因型分布的优势地域。结论：HBV D基因型病毒株传入来源、迁移的方向不同以及病毒株在具有不同遗传和免疫特质的宿主中的长期选择是形成HBV D基因序列病毒进化差异的原因。     

HIV-1 黑龙江省分离株CHNHLJ03009包膜克隆及分析

目的 分析黑龙江省Ⅰ型人免疫缺陷病毒（human irnmunodeficiency virus type 1，HIV-1）原代分离株包膜糖蛋白的变异性及表型特征。方法从一名HIV阳性但未发病的感染者外周血单个核细胞提取DNA，采用保守引物进行HIV包膜直接克隆，进行序列分析及系统树分析。构建了一株带该包膜蛋白的伪病毒并利用表达CXCR4和CCR5的靶细胞进行了感染实验，观察该病毒包膜利用辅助受体的表型特征。结果共获得2个有功能全长env克隆，分别命名为CHNHIJ03009c34（GenBank序列号为AY905493）和CHNHIA03009c33。用全长env氨基酸序列与国内外分离株进行同源性比较分析发现，与分离株CHNHLJ03009c34的包膜同源性最高的病毒为云南的HIV-1 B’亚型分离株RIA2，同源性为91．52％。系统发育分析结果表明，该株为泰国B’亚型，与云南分离株RIA2的遗传距离最近。对包膜蛋白结构分析结果显示，分离株CHNHLJ03009c34包膜在抗原性和亲水性上与RIA2没有明显差别。感染性检测结果显示该病毒只能感染U87．CD4．CCR5细胞，不能感染U87．CD4．CX-CR4细胞。结论本研究从黑龙江省一名HIV-1阳性者克隆到HIV-1CHNHLJ03009病毒的包膜基因，该病毒属于B’亚型（泰国亚型），为R5亲嗜性毒株。该包膜基因克隆为首次报道的黑龙江分离株。     

云南省蚊媒病毒分离物的初步鉴定

本研究对前期从云南蚊虫获得的病毒分离物作进一步鉴定,以明确其分类地位。采用甲病毒通用引物进行RT－PCR检测,在5株病毒分离物扩增出目的基因片段。新分离株4株来自三带喙库蚊,1株来自中华按蚊。它们可使白蚊伊蚊细胞（C6／36）、猴肾细胞（Vero）及金黄地鼠肾细胞（BHK－21）发生规律性细胞病变。核苷酸序列分析显示5株病毒与盖塔病毒（ Getah virus, GETV）同源性最高,与GETV中国云南YN0540株、河北株 HB0234、海南株 M1及南韩株、 LEIV MPR 株、鹭山病毒的同源性为96．4％～99．2％,5株病毒之间的同源性为98．4％～100％。系统进化分析结果显示,新分离株与上述GETV处于同一进化分支。以上结果证实5株病毒分离物为盖塔病毒。