钩端螺旋体赖株豚鼠感染模型的建立和免疫组化法对钩体抗原的检测

目的　建立钩端螺旋体赖型赖株感染豚鼠的动物模型 ,并用免疫组化法检测钩端螺旋体抗原在组织中的分布。方法　不同剂量钩端螺旋体赖株通过腹腔内注射感染豚鼠 ,观察豚鼠发病情况 ,及时解剖死亡豚鼠 ,HE染色观察肝、肾、肺等器官病变 ,EnVision二步法染色检测肝、肾、肺组织中钩体抗原。结果　感染后豚鼠发病 ,死亡与感染的钩端螺旋体剂量明显相关 ,大体标本及HE染色光镜下均出现典型钩体病病变。免疫组化显示在肝、肾、肺组织中均存在钩体抗原。结论　通过钩端螺旋体赖株腹腔注射的方法成功地建立了豚鼠动物模型。应用EnVision二步法染色 ,可有效显示组织中的钩体抗原。为进一步研究钩端螺旋体发病机制奠定了基础。     

两株不同毒力株钩端螺旋体37℃培养条件表达谱的差异

目的 钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）与钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）在遗传背景上具有很大的相似性，但毒力却差别很大。本研究利用钩端螺旋体的cDNA芯片在全基因组水平上研究毒力差别的机制。方法 利用钩端螺旋体的cDNA芯片，在37℃培养条件下以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）为测试株，以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）为对照株，测试了芯片表达谱的变化。结果 在37℃培养条件下，毒力株和减毒株的表达谱具有明显的差别。毒力株上调表达的基因有101个，下调表达的有71个。这些差异表达的基因在功能上可分为12类。结论 这些差异表达的基因可能在钩端螺旋体毒力株致病力方面发挥一定的作用。     

问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。     

螺旋体传染病：问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

[目的：通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA（LA0872），以及制备抗胶原酶的多克隆抗体，观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达，为研究其致病机制奠定基础。方法：以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板，用PCR扩增colA，产物克隆到表达载体pET-28b（＋）中，构建含coLA的重组质粒；将重组质粒转入E．coli Rosetta（DE3）菌株内，IPTG诱导表达后用Ni—NTA His-Bjnd寨和屡析梓绅化雷绢蛋白;[编者按]     

不同毒力钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

目的　了解不同毒力钩端螺旋体株有无属特异性外膜蛋白抗原。方法　TR/ patocⅠ钩体属特异性抗原免疫家兔获得抗血清 ,以显微镜凝集试验检测TR/patocⅠ属特异性抗原抗血清对我国 15群 17型问号钩体和 2群 2型双曲钩体的凝集情况。采用Auran介绍的方法制备问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株、波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株和双曲钩体三宝垄群Patoc型patocⅠ株的外膜蛋白 ,用SDS -PAGE及Westernblot分析不同毒力钩体外膜蛋白的电泳特征及与TR/ patocⅠ属特异性抗血清的反应性。结果　钩体TR/ patocI属特异性抗血清能与上述各株钩体发生凝集反应 ,其效价为 1∶2 5 6～ 1∶5 12。三种不同毒力钩体外膜蛋白有相似的SDS -PAGE图谱 ,其主要蛋白组分的分子量约为 6 0kDa ,Westernblot结果证实在约31kDa处有一共同的能与TR/patocI属特异性抗血清发生反应的阳性条带。结论　钩体细胞表面具有属特异性抗原 ,分子量31KDa外膜蛋白可能是属特异性抗原之一。     

猪链球菌2型BALB/c小鼠动物感染模型的建立

目的研究猪链球菌2型(SS2)中国高致病株05ZYH33株对BALB/c小鼠的致病性,探讨其作为SS2动物感染模型的可行性。方法用猪链球菌活菌经腹腔注射感染小白鼠,并做阴性对照。通过LD50测定、临床症状观察、病理剖检、病原分离鉴定、菌株在各脏器内定植分布检测、细胞因子测定,观察和分析小鼠感染SS2后机体的一系列改变。结果 BALB/c小鼠对05ZYH33株易感,其LD50为4×107 CFU/ml,并可区分强毒株和无毒株毒力差异;病原分离鉴定证实各脏器感染菌株均为SS2;涂板计数表明野生株05ZYH33在小鼠各脏器定植量显著高于无毒株Δcps2B;病死鼠的特征性组织病理学变化表现为典型的弥漫性血管内凝血和微血栓形成;野生株及无毒株均可引起炎症因子IL-6及趋化因子MCP-1的释放,但无毒株△cps2B诱导细胞因子水平显著低于野生株(P0.05)。结论 BALB/c小鼠可被SS2感染并引发炎症反应。适龄SPF BALB/c小鼠是中国SS2强致病株良好的动物感染模型。     

健康人群血清钩端螺旋体抗体调查

钩端螺旋体病（Leptospirosis，简称钩体病），是由致病性钩端螺旋体（Leptospira interrogans，简称钩体）引起的一种分布广泛的自然疫源性疾病，我国是受钩体病危害十分严重的国家。1937年汤择光首次报告3例钩端螺旋体病，1955年本病被列入法定传染病，迄今全国累计发病人数已超过250万。平均病死率约为1％。近年来我校面向全国十几个省市自治区招生，我们曾对本省籍在校学生钩端螺旋体感染情况进行过研究，为了解来自其他省市自治区学生钩端螺旋体感染状况，我们又对本校2003、2004级外省籍学生进行了血清钩端螺旋体抗体检测。     

螺旋体传染病

关于梅毒螺旋体感染血清学诊断方法选择的评价，江油市钩端螺旋体病高发原因研究，齿密螺旋体对小鼠T细胞IL-2 mRNA表达水平及活性的影响，重组表达梅毒螺旋体抗原血清反应性研究，问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定，赖型钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA的表达及其促细胞增殖效应。     

螺旋体传染病

1988-2003年雅安市钩端螺旋体病流行特征；新型钩端螺旋体的毒力调查；1998-2003年河南石油勘探局新疆探区人群莱姆病监测结果分析；我国4个钩端螺旋体血清群lipL21基因序列分析及其表达产物的鉴定；福建省新丙五价钩端螺旋体菌苗接种后反应与免疫效果的观察。     

钩端螺旋体病的免疫机理

<正> 钩端螺旋体(以下简称钩体)的免疫机理错综复杂,过去有些学者(1,2)认为体液免疫在钩体病的抗感染机理中起着决定性作用。但近年来也有学者(3,4)指出,钩体病的免疫机理中不能完全排除细胞免疫。下面就晚近发表有关钩体病的免疫机理问题作一扼要介绍。 细胞免疫 当钩体侵入机体后,首先表现为中性粒细胞及单核-巨噬细胞的增多。 一、中性粒细胞 Wang等(1984)为了观察中性粒细胞对钩体的防御作用,以非致病性钩体PatocⅠ及致病性钩体黄疸出血型23581株作为实验菌     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达

目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达。方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序。利用Bioedit、Dnaman、PSIPRED、NCBI及SignaIP等对其结构进行分析。最后在大肠杆菌JM109中诱导表达目的蛋白。结果不同毒力赖型钩体均能扩增出约600bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pGEX-Loa22构建成功:分析显示不同赖型钩体的Loa22的同源性很高,C末端都具有同OmpA一致的保守序列及肽聚糖相关基序,都有信号肽序列;表达产物经SDS-PAGE检测证明是目的蛋白。结论赖型钩体具有编码OmpA膜蛋白的Loa22基因,可能与赖型钩体毒力和免疫原性存在某种相关性。     

问号钩端螺旋体溶血素基因特征分析

目的　预测问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株致病因子———溶血素基因 ,并对其编码蛋白结构特征进行深入分析。方法　使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株溶血素基因诠释 ,所编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株 9个溶血素基因 ,分为两大类 :鞘磷脂酶类溶血素基因和非鞘磷脂酶类溶血素基因。并对溶血素基因编码蛋白二级结构、结构域、跨膜区域、信号肽及进化等进行了分析。结论　多种类型多条溶血素基因同时存在于钩端螺旋体菌中 ,暗示溶血素基因和钩端螺旋体致病性之间有密切的关系 ,可能在致病过程中起重要作用     

问号赖型钩端螺旋体23kDa蛋白的免疫原性研究

目的 探讨ｐＤＬ１２１的１．０ｋｂ０１７株问号赖型钩端螺旋体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的侯选。方法 采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ制备２３ｋＤａ蛋白,免疫日本大耳兔制备抗２３ｋＤａ抗血清,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定其免疫原性。结果 ２３ｋＤａ重组抗原兔抗血清可识别ｐＤＬ１２１体外表达２３ｋＤａ抗原产物和问号赖型钩端螺旋体０１７株超声抗原成份;用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ鉴定抗血清效价,其抗体     

Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans

Leptospirosis continues to be a disease with a poorly understood pathogenesis. The experimental rat model is amenable for the investigation of leptospiral dissemination, tropism, persistence of renal colonization and factors related to disease resistance. In this study, Wistar rats were infected intraperitoneally with virulent Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130. The detection of leptospires in tissue samples was based on culture, silver staining and immunofluorescence techniques. An inoculum of 10,000 leptospires induced colonization in 50% of rats and colonization persisted for the 4-month period of the study. Dissemination kinetics revealed that renal colonization took place 7-9 days after infection, with no underlying histopathology. The peak leptospiral load occurred on day 5 post-infection, followed by rapid clearance in all tissues except the kidneys, where dense leptospiral aggregates persisted in the renal tubules. We conclude that the experimental rat model is suitable for studies contributing towards the understanding of the mechanisms of colonization and resistance to severe disease in leptospirosis.     

Leptospirosis: clinical presentation and correlation with serovars

A total of 2400 patients with pyrexia of unknown origin and or suspected leptospirosis were included in this study. Dark field microscopy detected Leptospira in 690 cases, Leptospira serological Investigations proved positive in 570 out of these 690 patients. Among them 212 had the classical icteric and the other 358 had anicteric type of presentation. Notably eptospira interrogans serovar ictero haemorrhagiae infection was encountered in 212 patients. In 30 patients, who had multi organ dysfunction which included renal failure, hepatic dysfunction or meningitis was due to Leptospira interrogans Serovar cannicola. Coexsistense of leptospirosis and hepatitis B virus infection were noted in 15 patients. Antibody to Leptospira interrogans was demonstrated by Micro agglutination test (MAT) in addition to dark field microscopy positivity in these cases. Similarly HIV antibody was demonstrated in 30 of the 330 anicteric patients. 554 out of 570 cases responded to intra venous penicillin (216), and oral Doxycycline (182) and Augmentin (156), and the remaining 16 patients succumbed to death.     

新型钩端螺旋体的毒力调查

目的　对从安徽省金钱蛙肾中分离出的新血清群———顾群秦型人代表株EG79的毒力进行实验调查。方法　将生长状况良好的EG79钩端螺旋体注入豚鼠体内,观察豚鼠的活力、体温、体重的改变,七天后抽取心血做MAT和培养。将其解剖后取肾脏、肝脏做培养及PCR检查。结果　感染了EG79的豚鼠的活力下降,有发热、颤抖的现象;体重减轻、体温升高;病理解剖发现肝、肺有明显病变;PCR检测为阳性。分析EG79对豚鼠有一定的致病力,至于是否对人也有同样的致病能力,尚需要做进一步的实验以证明。