6A8 α-甘露糖苷酶表达减弱抑制鼻咽癌细胞CNE-2L2 转移的分子机制

目的 探讨6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对鼻咽癌细胞CNE-2L2间粘附性、细胞表达E-cadherin及对细胞接种裸鼠皮下所生长肿瘤肺转移的影响。方法 软琼脂培养观察非锚定状态下细胞间的粘附;间接免疫荧光染色、免疫组化染色及RT-PCR检测E-cadherin的表达;CNE-2L2细胞接种裸鼠皮下,8周后病理切片检测所长肿瘤肺转移程度。结果 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的CNE-2L2细胞(AS)在非锚定状态下发生粘附,此粘附对Ca^2 有依赖性。野生型CNE-2L2细胞弱表达E-cadherin,但AS细胞的E-cadherin表达明显增强。E-cadherin表达增强既见于蛋白质水平,也见于mRNA水平。AS细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。结论 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制使CNE-2L2细胞间的粘附性增强,细胞表面E-cadherin表达增强,细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。     

6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少

目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2细胞与层粘连蛋白的粘附及细胞表面片状伪足的影响。方法Western印迹检测6A8α-甘露糖苷酶的表达。置细胞于层粘连蛋白(laminin)包被的培养板孔中,37℃孵育1h后,用结晶紫染色细胞,用0.1mol/L枸橼酸钠/50%乙醇溶解结合到细胞中的染料。测定540nm处的吸光度值(AT),按R=AT/A100×100%计算粘附率(A100为100%粘附值)。扫描电镜观察细胞表面的片状伪足。结果6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的2个克隆细胞株(AS1和AS2)对层粘连蛋白的相对粘附率分别为0.447±0.096与0.533±0.065,而6A8α-甘露糖苷酶表达正常的对照细胞(W、M和S)的相对粘附率分别为0.78±0.035、0.7±0.05和0.80±0.04。两者的差别有生物学意义(P<0.01)。6A8α-甘露糖苷酶表达正常的细胞表面片状伪足丰富,6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞表面的片状伪足基本上消失。结论6A8α-甘露糖苷酶表达抑制可导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少。     

6A8 α—甘露糖苷酶酶解p—nitrophenyl—α—D—mannopyranoside

目的：明确6A8 cDNA编码蛋白质的α－甘露糖苷酶性质。方法：利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8 cDNA,将其插入到真核表达载体pCDI,转染COS－7细胞,用酶活性检测与Western blot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定。结果：拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8 cDNA碱顺序。转染重组表达载体pCDI-6A8的COS－7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α－D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3－4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制。Western blot检测显示在相对分子质量（Mr)120000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8 cDNA的细胞明显深盂民染空载pCDI及野生型细胞。结论：6A8 cDNA编码的蛋白质确为一种α－甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α－甘露糖苷酶。     

6A8 cDNA编码一种α-甘露糖苷酶

目的 探讨６Ａ８ ｃＤＮＡ编码的蛋白质的性质。方法 依据Ｃｏｎ Ａ的配体是基露糖,而α－甘露糖苷酶的作用是剪细胞糖蛋白聚糖中苷露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染６Ａ８ｃＤＮＡ正义或反义重组表达载体后,细胞结合ＣｏｎＡ的强弱,验证６Ａ８ｃＤＮＡ编码的蛋白质是否为一种α－甘露－糖苷酶。结果 ＣＯＳ－６ 人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ－２Ｌ２转染ｐＲｃ／ＣＭＶ－正交６Ａ８ｃＤＮＡ后与     

6A8α-甘露糖苷酶表达减弱和表达正常鼻咽癌细胞间的差异基因表达

目的发现因转导反义6A8 cDNA致恶性生物学行为减弱的人鼻咽癌细胞CNE-2L2(AS)和野生型细胞(W)间的差异表达基因.方法用DNA微列阵方法比较AS细胞和W细胞基因表达的差异.用Northern印迹和RT-PCR验证所得结果的可靠性.结果与W细胞相比,AS细胞有34个基因的表达上调,有42个基因的表达下调.其表达增强可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有P130mRNA for 130K protein、TGF-betaⅡR alpha、GABBR1、TGFBR1、TNFAIP1、STANIN、E-CADHERIN、CTNNA 1、CTNNA 2、RFX2及TMPO等,其表达减弱可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有CD44、NDRG1、TGFB1、RPS5、LEGUMAI、CBS、CD59及SNRPA1等.Northern印迹和RT-PCR验证了DNA微列阵方法检测的结果.结论与W细胞相比,AS细胞有34个基因表达上调,有42个基因表达下调,某些基因表达的改变可能与AS细胞恶性生物学行为的减弱相关.     

6A8α—甘露糖苷酶表达对人B淋巴细胞3D5增殖反应的影响

目的观察 6A8α-甘露糖苷酶表达对人 B细胞株 3D5增殖反应的影响。方法以重组腺相关病毒颗粒为载体,将正义 6A8 DNA或反义 6A8 DNA转导入 EB病毒转化的人 B细胞株 3D5,用单抗 6A8a染色反应和 Con A结合试验确认 6A8α-甘露糖苷酶高表达和低表达。以野生型细胞及转导空载载体的细胞作对照, MTT法检测细胞对 B细胞生长因子（ BCGF）、葡萄球菌 Cowen I（ SAC）或 IL- 6刺激的增殖反应。结果转导正义 6A8 DNA的细胞高表达 6A8α-甘露糖苷酶,转导反义 6A8 DNA的细胞低表达 6A8α-甘露糖苷酶。转导正义 6A8 DNA的 3D5细胞在 SAC诱导下的增殖反应明显增强（ P< 0.05）,但转导反义 6A8 DNA细胞的增殖反应无变化。对低分子量 BCGF或 IL- 6诱导的刺激,转导正义 6A8或反义 6A8对细胞的增殖反应均无影响。结论 6A8α-甘露糖苷酶活性增高使 3D5细胞对 SAC刺激的增殖反应增强。 6A8α-甘露糖苷酶活性变化对低相对分子质量 BCGF或 IL- 6诱导的增殖反应无影响。     

胞膜（Ecto）-6A8α-甘露糖苷酶

68Aα-甘露糖苷酶是本实验室克隆的eDNA(GenBank的登记号为AF044414)编码的一个新的人α-甘露糖苷酶^[1]。该cDNA长3300bp，其开放阅读框架编码1062个氨基酸的蛋白质。蛋白质的1028～1048aa为穿膜区。6A8α-甘露糖苷酶属Ⅰ型穿膜蛋白。6A8基因定位于第15号染色体q11～13区。     

CD44表达减弱致人鼻咽癌细胞CNE-2L2体外生长的抑制

目的探讨CD44表达抑制对人鼻咽癌细胞株CNE-2L2生长的影响。方法采用RNA干扰技术抑制细胞CD44表达,基因组PCR检测siRNA整合,Western blot检测CD44表达,CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit检测细胞生长,PI染色流式细胞仪检测细胞DNA含量。结果藉逆转录病毒转导入CNE-2L2细胞的siRNA均整合入了细胞基因组DNA。与整合了siegfp的对照细胞相比,整合了siCD44的细胞CD44表达均明显抑制,以整合了siCD44-1或siCD44-2的细胞中抑制最强。整合了siCD44-1或siCD44-2的细胞在培养中的生长明显受抑。细胞DNA含量分析显示野生型细胞、整合了siegfp的细胞、整合了siCD44-1的细胞及整合了siCD44-2的细胞处于G0/G1期的比例分别为44.4%、45.5%、53.9%及53.3%,处于S期的比例分别为39.3%、40.0%、27.1%及28.2%,处于G2/M期的比例分别为16.3%、14.5%、19.0%及18.5%。结论CD44表达减弱抑制了CNE-2L2细胞在培养中的生长,抑制细胞从G0/G1期进入S期,但略促进细胞从S期进入G2/M期。     

盐酸米托蒽醌诱导人鼻咽癌细胞CNE-2凋亡的研究

目的探讨盐酸米托蒽醌诱导人鼻咽癌细胞CNE-2凋亡作用和机制。方法用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测盐酸米托蒽醌对CNE-2细胞生长的抑制作用,流式细胞仪检测细胞内药物积聚量与细胞凋亡率之间的关系,共聚焦检测盐酸米托蒽醌在细胞中的定位。结果盐酸米托蒽醌对CNE-2细胞生长具有抑制作用,呈时间和剂量依赖性,并能有效诱导细胞凋亡,其在细胞中主要以斑点形式分布在细胞质中。结论盐酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌细胞CNE-2细胞生长,并诱导细胞凋亡,CNE-2细胞的药物敏感性与药物在细胞内的分布位置有直接关系。     

冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的放射增敏作用

目的:观察冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的放射增敏作用,并探讨其可能机制。方法:用克隆形成实验计算药物的放射增敏比,流式细胞仪法分别检测、比较单纯药物组、单纯照射组、联合治疗组各组的细胞周期变化。结果:冬凌草甲素的放射增敏比为1.227,流式细胞仪法分析显示,联合治疗组的细胞周期变化以G2/M期阻滞为主(45.2%),与单纯药物组、单纯照射组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞具有一定的放射增敏作用,其机制可能与改变细胞周期有关。     

白杨素对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的抑制作用

探讨白杨素对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的抑制作用及机制。采用CCK-8法检测细胞存活率,Hochest 33258染色检测细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期的变化,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3的活性。结果表明白杨素对CNE-2细胞的生长具有较强的抑制作用,并具有明显的量-效关系;白杨素可诱导CNE-2细胞凋亡,使G0/G1期细胞明显增多,S期明显减少,使细胞周期被阻滞于G0/G1期;白杨素可升高CNE-2细胞caspase-3的活性。白杨素对CNE-2细胞生长有明显的抑制作用,其机制可能与白杨素诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。     

表没食子儿茶素没食子酸酯通过下调存活素表达诱导鼻咽癌细胞株CNE-2凋亡的实验研究

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对鼻咽癌细胞株CNE-2的凋亡诱导作用以及这个过程中存活素(survivin)的表达变化特点.方法 应用噻唑蓝(MTT)法计算不同浓度EGCG作用于CNE-2鼻咽癌细胞后不同时间点的生长抑制率,并通过细胞荧光显微镜观察其凋亡情况,同时应用RT-PCR法检测这个过程中survivin mRNA的表达变化.结果 EGCG诱导CNE-2细胞凋亡,对其生长具有明显的抑制作用,并且存在时间和剂量依赖关系,同时伴有survivin mRNA的表达下调. 结论EGCG能诱导CNE-2细胞凋亡,明显抑制其生长,这种诱导凋亡的能力通过下调survivin mRNA的表达实现.     

鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱的建立

目的：建立人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,初步分析其蛋白质表达情况。方法：采用双向凝胶电泳（2-DE）分离人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2总蛋白,银染显色,Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析获取肽质量指纹图谱（PMF）,Mascot软件搜索MSDB和SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果：获得重复性和分辨率较好的CNE-2双向凝胶电泳图谱;质谱分析了78个蛋白质点,获取77张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了48个蛋白质。结论：建立了人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分蛋白质点,为人鼻咽癌蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据。     

塞来昔布对鼻咽癌细胞株CNE-2Z作用的研究

目的:探讨塞来昔布对鼻咽癌细胞株CNE-2Z的生长抑制作用及可能机制.方法:以人鼻咽癌细胞株CNE-2Z为研究对象,体外药物敏感试验(MTT)观察不同浓度和作用时间的塞来昔布对细胞的生长抑制作用;免疫细胞化学染色检测细胞增殖核抗原(PCNA)和环氧化酶-2(COX-2)的表达;流式细胞术(FCM)检测药物作用后细胞周期分布.结果:MTT试验显示塞来昔布对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖有抑制作用,其抑制效应具有时间及浓度依赖的特点;流式细胞术表明塞来昔布可引起CNE-2Z细胞GO/G1期阻滞;免疫组织化学检测显示塞来昔布下调PCNA、COX-2蛋白表达.结论:CNE-2Z细胞中存在COX-2表达,塞来昔布可抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖,可能成为鼻咽癌化疗的有效药物.