6A8 α-甘露糖苷酶表达减弱抑制鼻咽癌细胞CNE-2L2 转移的分子机制

目的 探讨6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对鼻咽癌细胞CNE-2L2间粘附性、细胞表达E-cadherin及对细胞接种裸鼠皮下所生长肿瘤肺转移的影响。方法 软琼脂培养观察非锚定状态下细胞间的粘附;间接免疫荧光染色、免疫组化染色及RT-PCR检测E-cadherin的表达;CNE-2L2细胞接种裸鼠皮下,8周后病理切片检测所长肿瘤肺转移程度。结果 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的CNE-2L2细胞(AS)在非锚定状态下发生粘附,此粘附对Ca^2 有依赖性。野生型CNE-2L2细胞弱表达E-cadherin,但AS细胞的E-cadherin表达明显增强。E-cadherin表达增强既见于蛋白质水平,也见于mRNA水平。AS细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。结论 6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制使CNE-2L2细胞间的粘附性增强,细胞表面E-cadherin表达增强,细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。     

6A8α—甘露糖苷酶表达对人B淋巴细胞3D5增殖反应的影响

目的观察 6A8α-甘露糖苷酶表达对人 B细胞株 3D5增殖反应的影响。方法以重组腺相关病毒颗粒为载体,将正义 6A8 DNA或反义 6A8 DNA转导入 EB病毒转化的人 B细胞株 3D5,用单抗 6A8a染色反应和 Con A结合试验确认 6A8α-甘露糖苷酶高表达和低表达。以野生型细胞及转导空载载体的细胞作对照, MTT法检测细胞对 B细胞生长因子（ BCGF）、葡萄球菌 Cowen I（ SAC）或 IL- 6刺激的增殖反应。结果转导正义 6A8 DNA的细胞高表达 6A8α-甘露糖苷酶,转导反义 6A8 DNA的细胞低表达 6A8α-甘露糖苷酶。转导正义 6A8 DNA的 3D5细胞在 SAC诱导下的增殖反应明显增强（ P< 0.05）,但转导反义 6A8 DNA细胞的增殖反应无变化。对低分子量 BCGF或 IL- 6诱导的刺激,转导正义 6A8或反义 6A8对细胞的增殖反应均无影响。结论 6A8α-甘露糖苷酶活性增高使 3D5细胞对 SAC刺激的增殖反应增强。 6A8α-甘露糖苷酶活性变化对低相对分子质量 BCGF或 IL- 6诱导的增殖反应无影响。     

6A8 α—甘露糖苷酶酶解p—nitrophenyl—α—D—mannopyranoside

目的：明确6A8 cDNA编码蛋白质的α－甘露糖苷酶性质。方法：利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8 cDNA,将其插入到真核表达载体pCDI,转染COS－7细胞,用酶活性检测与Western blot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定。结果：拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8 cDNA碱顺序。转染重组表达载体pCDI-6A8的COS－7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α－D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3－4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制。Western blot检测显示在相对分子质量（Mr)120000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8 cDNA的细胞明显深盂民染空载pCDI及野生型细胞。结论：6A8 cDNA编码的蛋白质确为一种α－甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α－甘露糖苷酶。     

6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少

目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2细胞与层粘连蛋白的粘附及细胞表面片状伪足的影响。方法Western印迹检测6A8α-甘露糖苷酶的表达。置细胞于层粘连蛋白(laminin)包被的培养板孔中,37℃孵育1h后,用结晶紫染色细胞,用0.1mol/L枸橼酸钠/50%乙醇溶解结合到细胞中的染料。测定540nm处的吸光度值(AT),按R=AT/A100×100%计算粘附率(A100为100%粘附值)。扫描电镜观察细胞表面的片状伪足。结果6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的2个克隆细胞株(AS1和AS2)对层粘连蛋白的相对粘附率分别为0.447±0.096与0.533±0.065,而6A8α-甘露糖苷酶表达正常的对照细胞(W、M和S)的相对粘附率分别为0.78±0.035、0.7±0.05和0.80±0.04。两者的差别有生物学意义(P<0.01)。6A8α-甘露糖苷酶表达正常的细胞表面片状伪足丰富,6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞表面的片状伪足基本上消失。结论6A8α-甘露糖苷酶表达抑制可导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少。     

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的：研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法：用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠，观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果：反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论：反义LMP1能成功抑制LMP1的表达，逆转NPC细胞的恶性表型，为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。     

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的　研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法　用反义LMP1DNA的真核表达载体anti—pcDNA3．1—LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2，G418筛选抗性克隆;Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达；用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞克隆；转染后LMP1蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降，集落形成能力显降低。结论　将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

ER α-甘露糖苷酶表达降低引起大鼠肝脏上皮细胞微绒毛减少变短

目的：观察蛋白质糖基化改变对大鼠肝脏上皮细胞WB-F344表面微绒毛及在培养中生长的影响。方法：构建含正义或反义6A8 DNA的重建pAGX( )质粒,用脂质体法将重组质粒或空载质粒转染WB-F344细胞,作G418筛选,以有限稀释法作细胞克隆,进行PCR检测新霉素抗性（neo^H）基因以确定转染DNA在细胞基因组中的整合;用P-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside作底物检测细胞匀浆上清中ER α-甘露糖苷酶的活性;采用扫描电镜观察细胞表面的微绒毛,并做生长曲线检测。结果：转染反义6A8的各WB-F344克隆细胞株的匀浆上清中,ER α-甘露糖苷酶活性有不同程度降低,其中以克隆AS1与AS2的降低最明显。克隆AS1与Con A结合增强,表面微绒毛减少、变短,细胞增殖减慢。结论：大鼠肝脏ER α-甘露糖苷酶表达抑制所致的蛋白质糖基化改变,可导致大鼠肝脏上皮细胞WB-F344微绒毛减少、变短,细胞生长速度减慢。     

蛋白激酶C对鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶活性的影响

为进一步探讨蛋白激酶C（PKC）调控入低分化鼻咽癌CNE－2Z细胞生长的机制，观察了PKC对CNE－2Z酶粒酶活性的影响。结果显示：CNE－2Z细胞有较高的端粒酶活性；PKC的抑制剂Staurosporine显著降低细胞端粒酶活性（P＜0．001）。提示抑制PKC可以抑制CNE－2Z细胞的端粒酶活性，PKC可通过调控端粒酶活性从而影响CNE－2Z细胞的生长。     

反义bcl—2 mRNA对人神经母细胞瘤细胞SH—SY5Y生长和凋亡的作用

目的：研究反义bcl-2 mRNA对人神经母细胞瘤（NB）细胞株SH－SY5Y的生长和凋亡的作用。方法：采用定向克隆构建携带反义bcl-2 cDNA片段的逆转录病毒载体PBabe-puro/Asbcl-2;应用脂质体Lipofectamine转染SH－SY5Y,经嘌呤霉素筛选,应用RT－PCR证实外源性反义bcl-2 mRNA的表达,建立细胞株SH－SY5Y／Asbcl-2,应用免疫组化和Western印迹分析Bcl－2蛋白的表达变化;MTT法做细胞的生长曲线观察细胞的生长情况;通过提取基因组DNA检测顺式氯铂（CP）诱导的细胞凋亡所形成的DNA梯带。结果：RT－PCR证实转染细胞SH-SY5Y/相A－2中有外源性反义bcl-2 mRNA的表达,免疫组化及Western印迹分析显示SH－SY5Y／Asbcl-细胞凋亡形成的DNA梯度更明显。结论：脂质体方法转染携带反义bcl-2 cDNA片段的转录病毒载体能够获得稳定转染和表达反义bcl-2 mRNA的细胞。反义bcl-2 mRNA可抑制内源性Bcl-2蛋白的表达,抑制SH－SY5Y的细胞的生长,增加SH－SY5Y细胞对CP的敏感性,促进细胞凋亡。     

腺病毒携带EB病毒LMP1反义基因抑制人鼻咽癌细胞的生长

[[摘要] 目的 研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法 用反义LMP1DNA的腺病毒载体AdEasy -GFP-ALMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2,Western2blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达;用MTT法和细胞生长曲线实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果 建立反义CNE2细胞;转染后LMP1蛋白表达降低;转染后细胞活力和生长速度均有下降。结论 将反义LMP1腺病毒载体导入细胞能成功抑制CNE2细胞的生长,逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。 [关键词] EB病毒 反义LMP1基因 鼻咽肿瘤 基因治疗     

c-erbB2反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响

目的 :探讨癌基因c -erbB2的反义寡苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响。方法 :设立c -erbB2正义寡核苷酸组和非处理组作对照 ,用RT -PCR检测卵巢癌细胞处理前后c -erbB2表达水平的变化。用MTT法及平板克隆形成试验检测人卵巢癌细胞株SKOV3在脂质体c-erbB2反义寡核苷酸作用前后受60 Coγ射线不同剂量照射后的细胞存活分数和集落形成率。结果 :c -erbB2反义寡核苷酸能抑制c-erbB2癌基因的表达 ,经脂质体介导的c-erbB2反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其存活分数和集落形成率较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降 (P <0 .0 1) ,而转染c -erbB2正义寡核苷酸组的存活分数和集落形成率与单纯照射组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 :c -erbB2反义寡核苷酸通过抑制c -erbB2的表达降低人卵巢癌细胞株SKOV3放射抗拒性。该作用可能与c-erbB2反义寡核苷酸抑制了引起细胞辐射抗拒的细胞信号转导途径有关。     

BCSC-1基因异位表达抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为

目的研究BCSC-1基因异位表达对人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性生物学行为的影响。方法RT-PCR扩增BCSC-1cDNA,分别构建原核重组表达载体pMAL-c2X-BCSC-1和真核重组表达载体pcDNA4/myc-HisA-BCSC-1。在原核细胞表达BCSC-1蛋白。用BCSC-1蛋白免疫新西兰白兔,制备BCSC-1抗血清。采用实时定量RT-PCR与用BCSC-1抗血清免疫荧光染色确认野生型CNE-2L2细胞的BCSC-1基因低表达。藉脂质体把pcDNA4/myc-HisA-BCSC-1转染入野生型CNE-2L2细胞。Westernblot检测BCSC-1基因在野生型CNE-2L2细胞异位表达。用体外培养中的生长曲线和集落生成检测细胞生长。接种细胞于裸鼠,定时测量肿瘤大小。小鼠肺做连续组织切片,观察肿瘤的肺转移。结果制备了BCSC-1抗血清。明确BCSC-1基因在野生型CNE-2L2细胞的表达极低。制备了BCSC-1基因异位表达的CNE-2L2细胞。与对照细胞(野生型CNE-2L2细胞和转染pcDNA4/myc-HisA的CNE-2L2细胞)相比,BCSC-1基因异位表达的CNE-2L2细胞在培养中的生长、集落生成、细胞的成瘤性生长和所长肿瘤的肺转移均明显抑制。结论BCSC-1基因异位表达对CNE-2L2细胞的恶性生物学行为有明显抑制作用。     

6A8 cDNA编码一种α-甘露糖苷酶

目的 探讨６Ａ８ ｃＤＮＡ编码的蛋白质的性质。方法 依据Ｃｏｎ Ａ的配体是基露糖,而α－甘露糖苷酶的作用是剪细胞糖蛋白聚糖中苷露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染６Ａ８ｃＤＮＡ正义或反义重组表达载体后,细胞结合ＣｏｎＡ的强弱,验证６Ａ８ｃＤＮＡ编码的蛋白质是否为一种α－甘露－糖苷酶。结果 ＣＯＳ－６ 人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ－２Ｌ２转染ｐＲｃ／ＣＭＶ－正交６Ａ８ｃＤＮＡ后与     

姜黄素对鼻咽癌细胞株CNE-2Z-H5增殖的影响

目的:研究姜黄素对人低分化鼻咽癌细胞系亚克隆株CNE-2Z-H5生长、增殖的作用。方法:应用姜黄素体外干预培养人低分化鼻咽癌细胞系亚克隆株CNE-2Z-H5,以绘制生长曲线、MTT及平板克隆形成实验观察姜黄素对CNE-2Z-H5细胞生长、增殖的作用。结果:细胞生长曲线、MTT及平板克隆形成实验均表明姜黄素对CNE-2Z-H5细胞生长、增殖具有抑制作用,并呈剂量效应关系。同时,超过一定浓度的姜黄素对CNE-2Z-H5细胞还具有细胞毒作用,可以体外杀伤CNE-2Z-H5细胞。结论:姜黄素可以有效抑制CNE-2Z-H5细胞的生长和增殖,具有明显的量效关系,可能对鼻咽癌的治疗具有一定价值。     

氯喹对鼻咽癌细胞凋亡的影响

目的:探讨氯喹(CQ)对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用MTT法检测不同浓度(0、2、4、8、16、32mol/L)CQ对鼻咽癌细胞CNE-2Z的增殖抑制效应;集落克隆实验法检测不同浓度CQ对集落克隆形成的影响;溴化丙啶单染检测CQ诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡;Western blot检测CQ(10mol/L)处理鼻咽癌细胞CNE-2Z不同时间(0、6、16、24 h)内质网应激反应标志物葡萄糖调节蛋白(GRP-78)的表达。结果:不同浓度CQ均对鼻咽癌细胞CNE-2Z具有明显的增殖抑制作用,16mol/L CQ作用于鼻咽癌细胞CNE-2Z 24、48、72 h细胞存活率分别为85.94%、75.34%和56.45%。同时,CQ具有抑制鼻咽癌细胞CNE-2Z的集落克隆形成的作用。并且,CQ呈剂量依赖性诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z的凋亡。另外,CQ诱导鼻咽癌细胞上调GRP-78的表达。结论:CQ能抑制鼻咽癌细胞增殖,并通过引起过度的内质网应激反应机制诱导其凋亡。     

补骨脂乙素对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 观察补骨脂乙素(IBC)对鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 采用CCK-8法检测不同浓度IBC对CNE-2Z细胞活性的抑制作用;EdU掺入法检测细胞增殖能力的改变;平板克隆形成实验检测对 CNE-2Z细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术AnnexinV-FITC/ PI双染法检测细胞凋亡情况;Western blot检测IBC作用后磷酸化核糖体S6激酶2(p-RSK2)、核糖体S6激酶2(RSK2)、c-Jun、B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的改变.结果 IBC对CNE-2Z细胞生长、增殖和克隆形成能力有明显的抑制作用,呈剂量依赖关系;与对照组相比,20、40 μmol/L IBC处理组细胞的凋亡率显著增高;IBC可引起CNE-2Z细胞中p-RSK2、c-Jun和Bcl-2表达明显减少,而Bax表达增高,与对照组相比,20、40 μmol/L IBC处理组Bcl-2/Bax比值分别下调47.24％和 69. 50％.结论 IBC可明显抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与抑制RSK2活性,进而调控 c-Jun和Bcl-2/Bax的表达有关.