利塞膦酸盐对BMSCs诱导的成骨细胞在脱钙骨支架上生物学行为的影响

目的:观察不同浓度利塞膦酸盐对脱钙骨支架中成骨细胞活性的影响.方法:选用含不同浓度利塞膦酸钠的培养液(10～-7、10-810-9,10-10 mol/L)对BMSCs诱导的成骨细胞与脱钙骨支架复合物进行培养,通过MTT,上清液碱性磷酸酶活性及Ⅰ型前胶原羧端肽、骨钙素检测对比观察不同浓度利塞膦酸钠对成骨细胞的作用效果.结果:MTT显示不同浓度利塞膦酸钠组细胞均随培养时间的增加而明显增殖,相同培养时间各不同浓度的利塞膦酸钠组的细胞增殖能力均高于对照纽(P＜0.05),且在10-10～10-7mol/L浓度范围内呈逐渐增加趋势.各不同浓度的利塞膦酸钠组的上清液ALP活性表达、Ⅰ型前胶原羧端肽表达、骨钙素表达均随培养时间的增加而明显增加,相同培养时间各组数值均高于对照组(P＜0.05),且在10-10～10-7 mol/L浓度范围内呈逐渐增加趋势.结论:利塞膦酸钠对成骨细胞在支架材料中的粘附、生长、增殖及骨化作用均有良好的促进作用.     

人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的 探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7(BMP7)诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能.方法 成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养.CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖(GAG),Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Yon Kossa染色法检测钙结节.结果 两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用.     

骨形态发生蛋白-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨对骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活件多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖、黏附及分化等生物学行为的影响. 方法制备重组胶原矿化骨支架材料,将BMP-2活性多肽通过交联剂共价结合到材料上,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;取第3代BMSCs接种到材料上,以未结合多肽的重组胶原矿化骨作为对照,采用MTT法检测BMSCs在材料表面的增殖;沉淀法检测BMSCs在材料表面的黏附率;扣描电镜观察比较BMSCs在材料表面的生长形态;通过检测细胞中的碱性磷酸酶活性及钙含量,观察BMSCs在材料表面的分化情况. 结果扫描电镜结果显示:支架材料旱多孔状;X射线光电子能谱法证实BMP-2活性多肽成功共价结合到材料表面;BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料表面BMSCs的黏附和向成骨细胞方向分化能力均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而BMSCs的增殖能力与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论BMP-2活性多肽可以显著改善重组胶原矿化骨复合材料的细胞相容性和生物活性,经BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料是一种理想的骨组织工程支架材料.     

Pluronic F-127表面修饰生物衍生骨的体外实验研究

目的：探讨成骨细胞复合PluronicF-127表面修饰生物衍生骨的三维培养，对成骨细胞活力及功能表达的影响。方法：将新鲜猪肋骨加工制成生物生骨，应用PluronicF-127对生物衍生骨进行表面修饰，然后体外复合第3代成骨细胞三维培养，实验为A、B和C组，A组为单纯生物衍生骨复合成骨细胞组，B组为PluronicF-127表面修饰生物衍生骨复合成骨细胞组，C组为单纯成骨细胞组，应用倒置相差显微镜和扫描电镜对各组成骨细胞生长及黏附进行观察，并对其细胞活力碱性磷酸酶（ALP）活性进行检测，结果：B组成骨细胞在支架材料上黏附，伸展及生长良好，成骨细胞活力和ALP活性表达与A组成骨细胞比较均无统计学意义（P＞0．05）；A、B组与C组比较，成骨细胞活性和ALP活性均明显降低，有统计学意义（P＜0．01）。结论：生物衍生骨经PluronicF-127表面修饰后具有良好的细胞相容性，可作为负载生物活性分子的载体修饰生物衍生骨。     

氟离子植入猪骨源羟基磷灰石对 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖与成骨分化的影响

目的 检测氟离子植入猪骨来源羟基磷灰石（PHA）对小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）黏附、 增殖及成骨分化的影响。方法 取猪骨松质用高温烧结的方法制备PHA，使用氟化钠浸泡结合二次高温 烧结进行氟离子植入，制备获得氟化猪骨源羟基磷灰石（FPHA）骨块，进行研磨获得颗粒材料后制备 压片，采用PHA颗粒制备的压片为对照组，采用FPHA颗粒制备的压片为实验组。在压片材料表面接种 小鼠MC3T3-E1前成骨细胞株，通过扫描电镜SEM观察不同时间细胞黏附形态，CCK-8法检测细胞增 殖情况，RT-PCR法检测细胞成骨相关基因碱性磷酸酶ALP、骨钙素BGLAP、骨桥蛋白OPN mRNA 的表达情况。结果 扫描电镜SEM观察可见，PHA与FPHA组细胞黏附生长良好；两组细胞接种1、7d 后OD值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；FPHA组接种3、5 d后OD值高于PHA组，差异有统计学 意义（P＜0.05）；RT-PCR结果显示，FPHA组细胞接种3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表达水平均高于 PHA组，且两组细胞接种7 d后材料表面细胞ALP与BGLAP mRNA表达水平均高于细胞接种3 d后，差异 有统计学意义（P＜0.05）。结论 PHA与FPHA材料均具有良好的细胞相容性，氟离子植入猪骨羟基磷灰 石可促进小鼠前成骨细胞早期增殖与成骨分化。     

改良复合磷酸钙骨水泥诱导分化成骨作用的体外研究

目的 通过体外实验观察兔骨髓基质干细胞(BMSCs)与改良复合磷酸钙骨水泥(BCPC)共培养的生物相容性及诱导成骨活性,探讨其可能的机制.方法 配制相同大小规格的BCPC及普通磷酸钙骨水泥(CPC)块,实验分为4组:空白对照组(不加载体)、普通CPC组、BCPC组、加BMP组(加BMP的BCPC).将各组材料与兔BMSCs复合培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,进行细胞计数,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞合成ALP活性变化,扫描电镜观察细胞在材料表面的生长及长入情况,real-time PCR检测成骨及成软骨相关基因mRNA表达情况并比较表达差别.结果 复合培养后倒置显微镜观察各组细胞与载体边缘接触良好,各组细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05);扫描电镜观察细胞在BCPC表面生长增殖良好,逐渐伸出伪足并长入材料孔隙;复合培养7 d后,BCPC组及加BMP组比CPC组和空白对照组表达更高的ALP活性,差异有统计学意义(P＜0.05);复合培养第10天,BCPC组及加BMP组分别与CPC组及空白对照组比较,其成骨及成软骨相关基因mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 配制的BCPC具有良好的生物相容性和一定的成骨诱导能力,其疏松的结构及更大的孔径适宜细胞长入材料内部.     

人脱细胞骨复合骨髓基质细胞成骨活性的实验研究

目的 研究人脱细胞骨(HAB)复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测。方法 用15％的过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养。通过碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行复合培养。8d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。结果 人髂骨块内细胞清除干净,骨基质保存良好;诱导后的骨髓基质细胞ALP和OCN水平明显高于对照组(P<0.05);复合后的人脱细胞骨培养液中ALP和OCN检测呈阳性;骨髓基质细胞在HAB支架内附着紧密,生长良好。结论 人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料。     

生物衍生骨支架材料的体外细胞相容性实验研究

目的 评价不同处理方法制备的生物衍生骨支架材料的细胞相容性。方法 将支架材料,即复合型完全脱蛋白骨（CFDB）、部分脱蛋白骨（PDPB）和部分脱钙骨（PDCB）与人胚骨膜来源的成骨细胞体外复合培养,采用倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、扫描电镜、流式细胞仪及碱性磷酸酶（ALP）活性检测,观察支架材料的细胞相容性。结果 三种材料上皆有细胞附着生长,三种材料对细胞增殖影响大小为PDCB＞PDPB＞CFDB;三种材料对成骨细胞的细胞周期影响较小,未见异倍体细胞;三种材料对成骨细胞ALP活性的影响大小依次为PDCB＞PDPB＞CFDB。结论 CFDB、PDPB及PDCB无细胞毒性、无致瘤性,皆有良好的细胞相容性,以CFDB为最好。三种材料皆可用于骨组织工程的支架材料。     

脉冲电磁场对新型低弹多孔钛合金表面成骨效应的影响研究

目的:观察脉冲电磁场刺激对新型低弹多孔钛合金支架表面的成骨效应。方法:使用3D打印技术制备多孔钛合金(Ti-24Nb-4Zr-8Sn,Ti2448)支架,并使用扫描电镜对支架的表面形貌进行观察;将成骨细胞接种于支架表面,给予脉冲电磁场刺激的支架为实验(PMEF)组,不给予脉冲电磁场刺激的支架为对照组;使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测两组细胞的增殖能力;使用活/死细胞染色观察两组细胞在支架上的活性;使用扫描电镜观察两组细胞在支架上的形态;通过实时定量PCR观察两组细胞相关成骨基因分化;通过兔股骨外侧髁缺损模型进行体内骨长入分析,分别使用荧光标记和Van Gieson染色观察两组支架的骨长入情况。结果:使用3D打印技术成功制备实验所需的多孔钛合金支架;PMEF组成骨细胞的增殖能力、细胞活性明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);PMEF组成骨细胞可见明显细胞伪足,细胞状态良好;PMEF组成骨细胞的成骨相关基因表达明显高于对照组(P0.05);术后4周和12周,PMEF组新生骨沉积速率(两种荧光间距)均高于对照组(P0.05),Van Gieson染色发现PMEF组骨长入明显多于对照组(P0.05)。结论:脉冲电磁场刺激和多孔Ti2448植入物的组合可为骨科、口腔和整形等领域的骨修复重建提供一种新方法和新思路。     

重组骨生长肽对组织工程性骨肌皮瓣影响的实验研究

目的探讨重组骨生长肽对组织工程性骨肌皮瓣的影响。方法自2004年12月至2005年5月,采用新西兰大耳白兔36只,在其髂后上棘抽取骨髓基质干细胞进行体外培养,诱导分化为成骨细胞。然后将第3代细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)、重组骨生长肽结合,共同培养14d后,经相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞的生长情况,最后分别将72块复合物植入36只白兔的双侧背阔肌中,构成组织工程骨肌皮瓣。含重组骨生长肽的一侧为实验组;含成骨细胞的一侧为对照组。术后6周,进行大体解剖观察,行HE染色,观察骨肌皮瓣的生长情况。结果骨髓基质干细胞可以诱导分化为成骨细胞,钙盐沉积,可形成不透光的矿化结节。在不同时间的骨髓基质干细胞,实验组ALP活性较对照组高(P<0.05),并表现为时间依赖性。扫描电镜显示:支架材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长,有良好的增殖活动。两组均可形成肌骨瓣,但实验组在成骨速度、成骨质量、血管化程度等方面均优于对照组。结论应用重组骨生长肽可成功地构建组织工程性骨肌皮瓣。     

重组人工骨修复实验性骨缺损影像学评价

[目的]探讨重组人胰岛素样生长因子-1（recombinant human insulinlike growth factor-1，rhIGF-1）／珊瑚羟基磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA）／自体红骨髓（autogeneous red bone marrow，ARBM）复合修复骨缺损的能力。[方法]成年中国家兔54只，随机分为3组，制成双侧桡骨中段11mm骨-骨膜全层缺损模型，每组18只，每组动物左右两侧缺损分别随机植入2种不同材料：1组两侧分别植入材料A（CHA／ARBM／rhlGF．1）和B（CHA／ARBM）；2组植入C（CHA／rhIGF-1）和D（CHA）；3组植入E（自体皮质骨）和F（缺损旷置）。术后行大体、X线（2、4、8、12周）和^99mTc—MDP骨扫描（12周）观察。[结果]A组X线片显示桥接骨痂生长良好，12周时缺损修复。12周^99mTc—MDP骨显像示A和E组修复区高度核浓聚。[结论]CHA／ARBM／rhIGF-1重组人工骨移植可协同实现骨传导、骨诱导和骨再生作用，促进骨缺损重建。     

The benefit of bone marrow concentrate in addition to a glass‐reinforced hydroxyapatite for bone regeneration: An in vivo ovine study

This study evaluates the ability of a Glass Reinforced Hydroxyapatite Composite (GRHC), in a new microporous pellet formulation with autologous bone marrow concentrate (BMC), to enhance bone regeneration and new bone formation. Ninety non‐critical sized bone defects were created in the femurs of nine Merino breed sheep and randomly left unfilled (group A), filled with GRHC pellets alone (group B) or filled with GRHC pellets combined with BMC (group C). The sheep were sacrificed at 3 weeks (three sheep), 6 weeks (three sheep) and 12 weeks (three sheep) and histological analysis (Light Microscopy‐LM), scanning electron microscopy (SEM) and histomorphometric analysis (HM) were performed. At 3, 6, and 12 weeks, HM revealed an average percentage of new bone of 48, 72, 83%; 25, 73, 80%, and 16, 38, 78% for Groups C, B and A respectively (significantly different only at 3 weeks p < 0.05). LM and SEM evaluation revealed earlier formation of well‐organized mature lamellar bone in Group C. This study demonstrates that the addition of a bone marrow concentrate to a glass reinforced hydroxyapatite composite in a pellet formulation promotes early bone healing. © 2017 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 35:1176–1182, 2017.

     

纳米陶瓷人工骨修复骨缺损的实验研究

目的通过动物实验探讨纳米陶瓷人工骨的骨缺损修复作用及相关问题,为其应用于骨缺损的修复提供依据。方法青紫兰兔45只在单侧桡骨制备骨缺损动物模型,随机分成3组(每组15只),然后用纳米陶瓷人工骨材料植入骨缺损处进行修复作为实验组,以植入陶瓷人工骨为对照组,空白组不植入任何材料;术后4、8、12周分别行大体标本观察、组织学、X线检查、扫描电镜(SEM)测试,比较三组间骨缺损区的成骨情况。结果纳米陶瓷人工骨成骨作用明显优于陶瓷人工骨组和空白对照组,差异有显著性意义(P<0．05)。结论纳米陶瓷人工骨具有良好的成骨能力、生物相容性和一定的降解率,是一种替代自体骨修复骨缺损较理想的材料。     

The bone histomorphometric study of the bone growth as revealed by scanning electron microscopy

The present study was made with a view to examining the availability of the SEM observation method for bone histomorphometry. On Wistar strain newborn rats, 3 segments for measurement, i.e. temporal segment, middle segment and sagittal segment were prepared in the central part of the parietal bone endocranial aspects, and the bone surfaces were observed by SEM up to the fifteenth day at intervals of five days from after birth to measure areal volumes of the resorbing bone surface, forming bone surface and intermediate surface and change in the number of osteocyte lacunae in the forming bone surface, using Zeiss IBAS 2000. The results revealed that the resorption process preceded the forming process for the temporal segment from about the tenth day, the forming process preceded the resorbing process from the fifth day for the middle segment and the forming process preceded from the beginning for the sagittal segment. These findings directly reflect an aspect of the growing process of parietal bone, making it possible to regard this SEM observation method as one of the effective approaches to the bone histomorphometry.     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架的生物矿化研究

目的 探究BMP2重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附脱钙骨(DBM)支架体外构建转基因组织工程骨的生物矿化能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs,用BMP2重组慢病毒转染细胞，通过RT-PCR检测目的基因的表达，利用倒置荧光显微镜观察细胞在DBM支架上的生长情况，借助扫描电镜和能谱分析观测细胞在DBM支架上的表面微观形貌及生物矿化能力。结果 BMP2重组慢病毒成功转染兔BMSCs, RT-PCR显示转染后细胞能高效表达BMP2目的基因，在倒置荧光显微镜下观察见转染后细胞黏附在DBM支架上呈满天星样，并沿DBM支架孔隙内壁贴壁叠加生长、分裂增殖，扫描电镜下见细胞填满整个DBM支架孔隙，分泌大量细胞外基质，并在DBM支架表面形成凹凸不平的光泽结晶矿化物，能谱分析显示其钙磷比(Ca/P)为1.89±0.31,与正常骨组织成分相近(P>0.05)。结论 BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架构建的转基因组织工程骨成功完成了生物矿化过程，体现出较好的生物矿化能力。     

Microvasculature of bone

The three dimensional vascular microarchitecture of mercox resin on the lateral surface of parietal bone in Wistar strain adult male rats (b. w. 260–350 g.) was studied in relation to bone formation by SEM observation of corrosion casts. The microarchitecture was a single layer of network composed of precapillary artery, capillary and postcapillary vein, which were serpigious, sometimes joined with the vein from the vascular foramen of bone. The meshes of this network, which were irregular and varied in size, existed apart from the bone surface. According to the report of Iwaku and Ozawa (1986), it was reported that the vascular microarchitecture of the bone surface was very changable during the process of bone remodeling and this network, which was shown on the flat bone surface in this study, was very similar to one in the resting phase and/or the period in which the bone formation further advanced. From these facts and the morphological features of the bone surface observed here by SEM, it is suggested that this vascular network was closely related with the resting stage and/or the period in which bone formation further advanced in bone remodeling.     

脱蛋白骨复合纤维蛋白胶构建骨组织工程支架的体外实验研究

[目的]探讨复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为骨髓基质干细胞（MSCs）支架材料的差异，为骨组织工程提供合适的复合支架材料。[方法]实验组使用复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与MSCs复合培养，对照组用单纯脱蛋白骨与MSCs复合培养，取不同时间点进行光学显微镜观察、扫描电镜观察、细胞DNA含量检测及钙结节染色比较两组细胞的情况。[结果]实验组骨髓基质干细胞在黏附能力与分泌情况明显优于对照组，细胞DNA检测表明实验组细胞增殖明显优于对照组（P〈0．05）。[结论]复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨比单纯脱蛋白骨更适合细胞生长，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程的构建。     

基于脂肪干细胞和藻酸钙凝胶构建可注射性骨的实验研究

目的：研究藻酸钙水凝胶一兔脂肪干细胞（ADSCs）复合物体内异位成骨能力,探讨其作为可注射组织工程骨的可能性。方法：使用藻酸盐溶液以2×10^3／ml的终细胞密度悬浮ADSCs,形成凝胶后注射于裸鼠背部皮下,8周后取材,通过大体标本观察、CT扫描、组织学检查,观察骨组织的形成情况。结果：皮下形成质地较硬的结节,阻射密度较高,组织学及电镜检查证实有骨样结构形成,单纯藻酸钙凝胶注射无新骨形成。结论：ADSCs与藻酸钙水凝胶可以分别作为种子细胞和支架载体构建可注射的晋细织     

异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察

[目的]探讨异种脱蛋白骨(heterogeneous deprotein bone,HDPB)复合物修复胫骨大段骨缺损过程中的血管化实验研究,为异种脱蛋白骨的临床应用提供实验依据。[方法]山羊24只,在右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%形成节段性骨缺损,实验组18只,植入异种DPB 自体MSCs rhBMP2,用半环槽式外固定器固定。于术后每隔4周对3只进行股动脉墨汁灌注后处死,取新骨组织制成厚切片观察血管化情况,以另6只植入自体骨为对照。[结果]术后4~24周,实验组与对照组血管表现数目逐渐增多,排列渐趋规则,血管大小、分布区域趋向均匀。测量血管数目和面积,结果显示4~24周2组血管数目和面积统计学分析差异无显著性意义(P>0.05)。[结论]异种脱蛋白骨复合物修复大动物大块骨缺损过程中血管化程度与自体骨相当,可以作为组织工程支架材料,并对其免疫原性和成骨能力等性能进行进一步研究。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。