人乳头瘤病毒16型L1的表达、病毒样颗粒组装及其免疫原性研究

目的 在原核表达系统中表达HPV16 L1蛋白,纯化后在体外自组装成VLPs并鉴定。方法 优化GenBank中HPV16 L1基因序列并截短C末端25个氨基酸,构建至原核表达载体pET-28a上,获得重组表达载体pET28a-16L1△C25。采用镍亲和层析法纯化超声上清,于体外解组装-重组装HPV16 VLPs,采用动态光散射和透射电镜进行形貌分析,纯化后于第0、2和4周免疫小鼠,假病毒中和试验检测HPV16 VLPs免疫后血清中和抗体。结果 双酶切和测序结果表明成功构建pET28a-16L1△C25重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blotting分析显示表达的L1蛋白大部分以可溶性形式存在,纯化后的蛋白样品于体外重新组装,动态光散射和透射电镜能够观察到形态与天然病毒颗粒相似的VLPs,第6周小鼠血清中和抗体滴度Log10平均值达到4.43。结论 利用原核表达系统成功表达了截短型HPV16 L1蛋白,并于体外组装成结构完整的VLPs,且具有较好的免疫原性,为低成本HPV预防性疫苗的研发奠定基础。     

人胰岛新生相关蛋白基因毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP)载体毕赤酵母.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒αINGAP/pPIC9K.电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,Western blotting鉴定目的 蛋白,ELISA法定量测定其含量.结果 重组表达质粒αINGAP/pPIC9K经酶切获得758bp片段,符合α因子与INGAP片段融合的长度,筛选得到3个阳性转化子,培养上清含有与抗INGAP抗体反应的蛋白.结论 成功构建了分泌INGAP蛋白的毕赤酵母菌株.     

人胰岛新生相关蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的 将在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物实验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K, 筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达及纯化.     

猪带绦虫六钩蚴表膜结合蛋白45WB2基因在毕赤酵母中的表达

目的 从猪带绦虫六钩蚴总RNA中扩增45WB2基因,并在甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K中获得高效表达。 方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR), 从孵化激活的六钩蚴克隆获得459 bp的基因, 亚克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K中, 经测序验证读码框正确后, 重组质粒电转化毕赤酵母SMD1168菌株。用PCR方法检测结果表明, 目的基因整合进毕赤酵母染色体DNA中。 重组菌株用1%甲醇诱导, 分别取诱导 72和96 h的上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。 结果 重组菌株在毕赤酵母中的表达蛋白分子量为Mr 16 000, 表达产物占上清总蛋白量的32.8%, 且能被猪囊尾蚴病患者血清识别。 结论 基因在毕赤酵母中成功表达, 表达产物有望作为免疫原用于猪囊尾蚴病的免疫预防。     

家蝇抗菌肽Attacin在毕赤酵母中的异源表达

目的构建家蝇抗菌肽(攻击素,attacin)成熟肽的重组表达质粒并转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,诱导attacin表达。方法 PCR扩增家蝇抗菌肽attacin基因成熟肽编码区,克隆至酵母表达载体pPIC9K中,将重组质粒pPIC9K-attacin用SacⅠ酶切线性化后,采用电转化法将其转入毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株。甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC9K-attacin的表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定表达产物,采用琼脂糖孔穴扩散法检测其对大肠埃希菌K12D31的抑制作用。结果重组表达质粒pPIC9K-attacin构建成功,电转化获得多拷贝整合转化子毕赤酵母GS115/pPIC9 K-attacin,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,在约Mr22000处有蛋白条带,表达产物可抑制E.coli K12D31的生长。结论家蝇抗菌肽attacin在巴斯德毕赤酵母中成功进行了表达。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因的酵母表达载体构建

目的构建蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因,将其克隆到甲醇酵母,建立分泌表达载体pPIC9K。方法设计、合成蜱抗凝血肽与RGDS肽的双功能分子的重组基因,对人工合成的目的基因片段进行酶切、测序鉴定。运用PCR技术,扩增目的基因,PCR产物经胶回收后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PCR、酶切鉴定和DNA测序证明双功能基因重组质粒构建成功。结论该方法能方便、高效地获得所需的多拷贝基因,为下一步在毕赤酵母中表达双功能分子蛋白建立了基础。     

弓形虫GRA1基因在毕赤酵母菌中的表达、纯化与鉴定

目的研究弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)在毕赤酵母菌中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的目的蛋白。方法将已构建重组的pPIC9K-GRA1质粒转化入酵母菌GS115,筛选His Muts表型转化子,摇瓶培养,1%甲醇诱导表达。表达产物经高效液相色谱法纯化后,测定其生物学活性。结果诱导4d的蛋白表达量达到2.5g/L。SDS-PAGE显示表达蛋白的分子质量单位为24ku,Westernblot鉴定表达产物具有抗原性。表达蛋白经高效液相色谱纯化产物后纯度达到90%以上。结论弓形虫GRA1基因在毕赤酵母中成功分泌表达目的蛋白,表达产物具有抗原性。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学功能鉴定

目的在毕赤酵母中分泌表达细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Echinococcus granulosus thioredoxin peroxidase,EgTPx),并检测其抗氧化活性。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR获取EgTPx的cDNA片段并克隆至分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-EgTPx,电穿孔法转化毕赤酵母菌株GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA,采用PCR鉴定Mut表型,阳性克隆经甲醇诱导表达EgTPx蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并检测其抗氧化活性。结果酶切和测序证实重组表达质粒pPIC9K-EgTPx构建正确,表达的目的蛋白分子质量单位约为22ku,该蛋白可被鼠抗EgTPx多抗识别,且具有较强的抗氧化活性。结论在毕赤酵母表达系统中成功表达了EgTPx,该蛋白具有免疫反应性和抗氧化活性。     

pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体的构建及体外表达

目的构建毕氏酵母表达载体pPIC9K/Ang-1,并进行体外表达研究。方法从PGEM-T/Ang-1载体中切取目的片段Ang-1,利用定向克隆到毕氏酵母表达载体pPIC9K中,测序正确后,pPIC9K/Ang-1载体经SalⅠ酶切线形化,以电转化法导入GS115毕氏酵母菌株中,经YPD平板G418抗性筛选后获得Ang-1表达阳性菌株;用SDS-PAGE测定其分子量,用Western Blotting检测发酵上清中Ang-1的抗原性和表达量。结果成功切取1.5 kb的Ang-1片段,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致。酶切线性化的质粒成功转入GS115毕氏酵母中,诱导表达后SDS-PAGE显示重组人Ang-1分子量约66 kD,Western Blotting证实为人Ang-1。结论成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,成功获得稳定分泌Ang-1重组蛋白的基因工程菌株。     

利用毕赤酵母菌SMD1168表达SSA重组抗原

目的利用电穿孔法将pPIC9k-SSA重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获得SSA重组抗原。方法以人白血病淋巴细胞HL-60株为模板扩增SSA基因,将其转入pPIC9k质粒构建pPIC9k-SSA重组质粒,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,获取目的蛋白。结果成功构建pPIC9k-SSA重组质粒并导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中,获得稳定整合目的基因的菌株;重组菌株经诱导表达出产物相对分子量约为50kDa的SSA蛋白,具有抗原性可与SSA抗体特异性结合。结论本实验室通过分子克隆技术,从毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中获得了人SSA抗原,为今后建立斑点免疫金渗滤法(DIGFA)法检测抗SSA抗体奠定基础。     

恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因在毕赤酵母系统中的高效表达

目的　利用毕赤酵母高效表达系统表达用于下游实验的恶性疟原虫AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白。方法　将测序正确的AMA - 1(Ⅲ )基因插入毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9k中 ,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115 ,筛选高拷贝转化子 ,利用甲醇进行诱导表达。表达产物用SDS -PAGE和免疫印迹进行检测。结果　AMA - 1(Ⅲ )蛋白表达于培养上清 ,蛋白的相对分子质量分别为 16 .3ku ,免疫印迹结果表明AMA - 1(Ⅲ )基因表达蛋白能被抗AMA - 1(Ⅲ )的单抗所识别 ,出现特异条带 ,推算AMA - 1(Ⅲ )蛋白的表达量为 0 .8g/L。 结论　酵母细胞表达系统可高效表达在构象方面接近天然蛋白的AMA - 1(Ⅲ )重组蛋白     

间日疟原虫多表位疫苗基因的表达、纯化与初步鉴定

目的构建和筛选间日疟原虫多表位疫苗基因高拷贝Pichia pastoris菌株,研究多表位疫苗基因在酵母菌中的表达,纯化目的产物,为进一步的多表位肽免疫原性研究奠定基础。方法根据文献报道筛选间日疟原虫有效保护性抗原表位,人工合成多表位基因PvDBW,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切构建酵母表达载体pPIC9K-PvDBW,转化大肠埃希菌ToP10;鉴定后转化P.pastoris GS115,构建酵母表达菌株;通过G418压力筛选筛出目的基因高拷贝克隆,用甲醇诱导多表位肽基因表达,分别以RT-PCR和Western blot进行鉴定,用50%饱和硫酸铵沉淀和分子筛凝胶层析分离、纯化目的产物。结果重组质粒用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后可得到786 bp DNA片段;经G418压力筛选筛出两个高拷贝菌株,以α-Factor和3′AOX1为引物、重组菌基因组DNA为模板,PCR扩增出约960 bp的目的片段;SDS-PAGE显示,在GS115细胞内多表位肽呈分泌性表达,表达量为80 mg/L;分离、纯化后,纯度达90%以上;Western blot检测显示表达的多表位肽可被间日疟病人血清识别。结论间日疟原虫多期多阶段多表位疫苗基因在酵母菌中表达成功。     

白纹伊蚊蜕皮激素拮抗剂筛选酵母模型的建立

目的 在毕赤酵母体内构建白纹伊蚊蜕皮激素转录活化系统, 建立高通量杀虫剂筛选模型，用于筛选蜕皮激素代谢途径拮抗药物。 方法 人工合成果蝇蜕皮激素响应元件（EcRE）5次重复的序列, 与果蝇热激蛋白基因启动子（pHSP27）序列连接, 以绿色荧光蛋白（GFP）报告基因, 将EcRE-pHSP27-GFP片段亚克隆入pPIC3.5k, 整合入毕赤酵母染色体构建阴性酵母A。人工合成白纹伊蚊蜕皮激素受体(EcR)及超螺旋蛋白（USP）编码序列, 两个基因以双表达盒形式亚克隆入组成型表达质粒pGAPZ, 整合入酵母染色体的另一位点, 使EcR与USP在酵母中组成型表达, 构建模型酵母B。制备蜕皮激素拮抗剂虫酰肼悬液（浓度为0.83 mg/ml），分别施加于模型酵母B与阴性酵母A，荧光显微镜下目测荧光强度，与未施加药物的对照组比较。同时提取各组RNA，半定量RT-PCR检验GFP基因的转录效率。 结果 模型酵母B发出绿色荧光， 而阴性酵母A与空白酵母GS115未见荧光，表明在模型酵母体内表达的EcR与USP形成复合二聚体，作用于EcRE启动GFP报告基因表达荧光蛋白。施用虫酰肼，模型酵母B荧光强度明显减弱，表明GFP的表达量减少。施用虫酰肼的模型酵母B, GFP与内参灰度比值(为0.614)低于对照组(1.134)，表明虫酰肼可降低模型酵母B体内GFP基因的转录水平。 结论 在酵母体内建立了白纹伊蚊蜕皮激素转录活化系统，该酵母模型可用于筛选作用于蜕皮激素代谢途径的药物。     

猪囊尾蚴抗原cC1在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的　克隆并在巴斯德毕赤酵母中表达猪囊尾蚴抗原cC1。方法　用PCR法在cC1cDNA5′端引入所需限制酶位点和酵母分泌信号肽 ,与酵母表达载体pPIC9k重组 ,构建表达质粒 pPIC9k -cC1。采用电穿孔法转化酵母菌SMD116 8,在MD平板上筛选重组克隆 ,用G4 18快速筛选高拷贝转化子 ,阳性克隆经甲醇诱导表达后 ,培养上清SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　PCR产物经测序无误 ,pPIC9-cC1和 pPIC9k -cC1酶切分析与预期相符 ,获取 86 3个酵母阳性重组克隆及9个高拷贝转化子。表达产物cC1的分子量约 4 2kDa ,占分泌总蛋白 80 %以上 ,产物浓度为 2 0 0 - 35 0mg/L。Westernblot证实表达产物具有天然cC1分子的免疫原性。结论　在巴斯德毕赤酵母中成功表达了猪囊尾蚴cC1抗原 ,为进一步研究打下基础     

整体重组酵母抗乙型肝炎病毒的初步研究

目的 借助酵母的免疫特性，设计一种新型抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗性疫苗，探索一种全新的可有效活化机体抗病毒免疫应答方式。方法 以基因工程技术构建内含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白(HSP)70(1～370)—HBsAg的重组毕赤酵母，皮下免疫BALB／C小鼠，检测小鼠对HBsAg的体液及细胞免疫反应。结果 重组酵母成功诱导了小鼠体内表面抗体的产生，显示其抗原性并未受到影响。细胞免疫检测未能获得预期的结果。结论 整体重组酵母活菌具有疫苗特性，整体重组酵母用于抗HBV治疗是一个新的思路，未能检测到细胞免疫反应可能与重组酵母的用量，注射方式等有关。