恒河猴骨髓基质细胞体外诱导分化成神经干细胞的实验研究

为研究恒河猴骨髓基质细胞（BMSC）体外培养及诱导分化为神经干细胞的可行性，分离恒河猴BMSC，在体外应用神经干细胞培养液和细胞因子进行诱导分化，利用免疫细胞化学方法进行鉴定。结果发现，恒河猴BMSC能在体外培养中增殖，分化和表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白（Nestin)，并最终能分化为胶质细胞样细胞和神经元样细胞；免疫细胞化学检测可见有神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）抗原表达；未发现维甲酸（RA），表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)对骨髓基质干细胞的诱导分化具有明显影响作用。提示恒河猴BMSC是具有较强的自我更新能力和多分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为表达神经系细胞（神经元和神经胶质细胞）抗原的细胞，可作为神经细胞的种子细胞。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经干细胞和成熟神经细胞分化的实验研究

探索骨髓基质细胞（BMSCs）分化为神经干细胞和成熟神经细胞的可行性，为BMSCs在神经科学领域的应用提供依据。以犬的BMSCs为实验对象，利用bFGF、RA、GDNF等作为增殖或分化诱导因子，对各阶段细胞进行免疫细胞化学鉴定。结果发现，增殖培养24－72h见细胞分裂像和克隆单位；诱导培养3天，部分细胞开始表达NSE或GFAP，继续增殖培养仍可见细胞克隆（干细胞特性）；诱导培养第10天有成熟神经细胞形成（成分鉴定证实）。说明BMSCs在体外培养条件下，经过多种因子的“程序性”作用，可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化。提示BMSCs可作为“种子细胞”在神经科学领域加以利用。     

狗骨髓基质干细胞体外分化为肌源性细胞的初步观察

用贴壁法体外分离骨髓基质干细胞，实验组5—氮胞苷诱导，对照组加入等量培养基，用相差显微镜和免疫组织化学方法观察、鉴定培养细胞。探讨成年狗骨髓基质干细胞体外诱导分化为肌细胞的可行性，为心肌梗死和心力衰竭的细胞移植治疗提供新的细胞系。结果表明，实验组诱导后4周，多数培养细胞由梭形变为杆状，免疫组织化学检查结蛋白、平滑肌肌动蛋白和肌钙蛋白I染色阳性；对照组多数培养细胞为梭形，免疫组织化学检查结蛋白染色弱阳性，平滑肌肌动蛋白染色弱阳性，肌钙蛋白I染色阴性。结果提示，成年狗骨髓基质干细胞体外可诱导分化为肌源性细胞。     

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性和有效性     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展

骨髓间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体,MSC既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性,获取简便,体外培养条件不高,分离增殖能力强,可以自身获取,因此它可以作为种子细胞。与造血干细胞相比,MSC在疾病治疗上更为理想。目前MSC及其在组织工程方面的研究已取得较大进展。     

骨髓基质细胞的体外培养与临床应用

目的　验证骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSCs)向成骨细胞转化的能力及其临床应用价值。方法　取健康成年大白兔股骨大转子红骨髓 ,在DMEM标准培养液中原代培养骨髓基质细胞 ,传代细胞分别用DMEM标准培养液和加入地塞米松、β 甘油磷酸钠、L 抗坏血酸的条件培养液培养 ,倒置显微镜观察不同培养条件下细胞的形态学特征 ,进行酶学测定 ,计数传代细胞中成骨样细胞转化率 ,免疫组化法检测Ι型胶原表达。同样方法培养人BMSCs,与同种异体骨基质明胶充分混合 ,应用于临床修复创伤所致的骨缺损、骨不连或骨折延迟愈合。结果　体外培养条件下 ,原代细胞呈长梭形 ,具有成纤维细胞的生长特性 ,条件培养的传代BMSCs变为三角形或锥形 ,呈多层生长 ,无接触抑制现象 ,具有与成骨细胞相似的形态和生长特点。ALP染色阳性率可达 85 %以上 ,Ι型胶原免疫组化染色呈强阳性 ,具有与成骨细胞类似的功能性表现。临床应用 4 2例病人 ,随访 8～ 2 6个月 ,取得了满意疗效。结论　BMSCs能够向成骨细胞分化和增殖 ,是骨组织工程学种子细胞的理想来源 ,并有广阔的临床应用前景     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

SD大鼠神经干细胞培养鉴定实验研究

为探讨从SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质分离并鉴定神经干细胞的可行性 ,以从上述部位分离的细胞作为种子细胞来源 ,在本实验室特制“CYTOKINE·神经干细胞培养基”中进行了神经干细胞培养诱导 ,单细胞连续传代培养 ,并分别以Nestin、NSE及GFAP免疫抗体鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结果发现 ,4种来源的组织细胞在相应培养条件下均有神经干细胞快速增殖 ,并有由多细胞组成的神经球形成 ,经鉴定 ,该细胞球表达特殊的胚胎神经干细胞Nestin抗原 ;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度进行培养 ,单个的细胞又很快形成神经球。对神经干细胞进行连续培养或加血清传代培养可使其进一步分裂增殖 ,有小芽形成并发育成突起、建立神经纤维联系 ,其中有的胞体增大 ,逐渐发育为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接 ,交织成网 ,经鉴定为神经元及神经胶质细胞。 4种组织来源的细胞中所含有的干细胞数量不同 ,胎鼠较成年鼠更富含神经干细胞 ,室管膜或脑室下区所含神经干细胞较皮质更丰富 ,皮质来源的神经干细胞和室管膜来源的神经干细胞在形态学和分化程度上无特殊区别。该结果提示 ,SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质 4种组织来源的细胞均含有神经干细胞 ;神经干     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

人骨骼肌细胞体外分化过程及特征

为研究人骨骼肌细胞（HSMC）体外分化模式及其生物学、形态学、生化学特征,在体外培养HSMC,并进行免疫组化鉴定,细胞生物学和形态学观察、肌酸激酶（CK）及蛋白质含量测定。结果发现,体外培养的HSMC能达到高度分化;CK活力、肌细胞蛋白质合成与其分化、成熟程度及肌管的功能状态呈正相关。提示HSMC体外重新分化过程与在体相似。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性

从人骨髓中分离人间充质干细胞（ＭＳＣｓ）,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态,ＭＴＴ实验检测不同细胞因子对细胞增殖的影响。应用流式细胞学技术测定细胞周期及细胞表面抗原特征并观察细胞组织化学特点。结果：ＭＳＣｃ具有独特的表征,即ＣＤ２９,ＣＤ４４,ＣＤ１６６阳性,ＣＤ３４,ＣＤ４５,ＨＬＡ－ＤＲ和荆豆素阴性。细胞化学结果显示,几乎所有细胞酸性萘酚醋酸酯酶（ＡＮＡＥ）及糖原（ＰＡＳ反应）阳性,酸性磷酸酶（Ａ     

用组织工程方法修复山羊胫骨骨缺损的实验研究

制备组织工程用山羊胫骨骨缺损模型，研究用组织工程的方法修复山羊胫骨骨缺损的可行性。27只中国山羊制备单侧胫肌中段20mm 的骨膜与骨缺损，7孔钢板内固定，随机分3组：空白组不进行植入处理；对照组（CHAP组）单纯植入羟基磷灰石（CHAP）；实验组（CHAP／BMSc组）植入CHAP 与骨髓基质细胞（BMSc）的复合物。术的4、8、12周放射学检查X线片光密度指数比值、组织学方法评价各组骨缺损修复情况，12周CHAP／BMSc组与CHAP组做压应变与三点弯曲试验，评价骨缺损修复后的生物力学性质。结果显示，术后4、8、12周X线片光密度指数比值空白组无明显变化，CHAP组低于CHAP／BMSc组（P＜0．05）；组织学切片显示CHAP／BMSc组成骨较CHAP组早、多；12周三点弯曲实验载荷、弯曲应力CHAP／BMSc组高于C组（P＜0．05）。提示山羊胫骨20mm骨与骨膜缺损不能自行修复，可满足骨组织工程大动物实验需要；CHAP与BMSc复合物修复骨缺损在成骨时间、成骨量与质量上均优于单纯CHAP.     

子宫内膜细胞的培养和侵袭性研究

为探讨不同子宫内膜细胞在子宫内膜异位症(EM）发病机制中的作用，体外分离培养EM患者和对照组子宫内膜共49例。观察间质和上皮细胞的形态学特点，并采用Transwell—Col Insert细胞培养板，比较不同细胞的侵袭行为。结果显示，间质细胞侵袭能力强于上皮细胞；EM组子宫内膜细胞侵袭力强于对照组。提示在子宫内膜异位种植过程中，间质和上皮细胞可能具有不同的功能；EM患者子宫内膜本身具有不同于对照组的特性，使其更易于异位种植生长。