β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌对乳糖细胞毒性的缓解作用

目的体外评价β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌缓解乳糖对细胞毒性作用的效果。方法建立乳糖细胞毒性作用Caco-2细胞模型,采用形态学观察及细胞增殖活性等指标检测该菌对乳糖细胞毒性的作用效果。结果成功建立乳糖细胞毒性作用Caco-2体外模型,所构建的β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌能够保护细胞耐受乳糖毒性而呈现正常形态,并能提高乳糖作用下的细胞活性（P〈0．01）。结论β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌在体外可显著的降低乳糖的细胞毒性作用,为进行其食品级改造奠定了基础。     

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

组腺病毒Ad-B-gal,病毒滴度达(2.5～4.0)×1011EFU/ml;感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10时对HEK293细胞48 h转染率达70%,并在X-gaJ试剂作用下,细胞旱现蓝色.结论 成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒,能高效感染293细胞.并功能性表达β-半乳糖苷酶.     

α-半乳糖苷酶的医学研究进展

本文综述α-半乳糖苷酶在医学领域的应用,分析α-半乳糖苷酶与Fabry疾病、血型转换和异种器官移植的关系和研究进展.     

非融合表达β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌的构建和性能研究

目的 构建能非融合表达高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,并对其酶活性和分泌性能进行研究.方法 提取能在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶的重组质粒pMG36e-lacZ 1.1480和pMG36e-lacZ wch9901,电转化乳酸乳球菌乳酸亚种MGl363.测定重组菌在不同培养时间和乳糖浓度下的β-半乳糖苷酶活性,及在不同培养条件下的酶分泌率.结果 携带pMG36e-lacZ wch9901的重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36e-lacZ wch9901)具最高酶活性,其β-半乳糖苷酶活性达(16.95±0.09)U/mg pro,为基因初始菌的2.75倍;重组乳酸乳球菌培养24 h产酶达高峰;培养基含乳糖时,重组菌酶活测定结果表现为降低;重组乳酸乳球菌表达的β-半乳糖苷酶可分泌到培养基中,当培养基不含红霉素,而含20 g/L乳糖时,分泌率最高,达(27.09±0.05)%.结论 获得了能非融合表达和分泌高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,可在此基础上进一步研制β-半乳糖苷酶活菌释放体.     

成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化

目的 观察正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。方法 取正常人二倍体成纤维细胞进行传代培养，以不同代次的细胞为实验对象，通过细胞生长曲线、群体倍增时间和β-半乳糖苷酶染色等一系列检测方法，对成纤维细胞老化过程进行了观察。结果 随着成纤维细胞的连续传代培养，SA-β-Gal表达呈现从弱(在年轻细胞中占4％)到强(在老化细胞中占60％)的趋势、结论 为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据。     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定

目的：制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β- galactosidae）酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法：以pSV-β- galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果：获得与pSV-β- galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14 000及116 000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论：成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。     

何首乌饮对Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响

目的:探讨何首乌饮对eydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响.方法:采用3 β-HSD特异性染色鉴定体外培养的大鼠睾丸Leydig细胞,分为正常组、Leydig细胞衰老损伤组、何首乌饮预防组和何首乌饮治疗组,用50 μ mol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4处理Leydig细胞建立Leydig细胞衰老模型.观察各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶表达的变化.结果:正常组Leydig细胞无β-半乳糖苷酶表达.与正常组比较,衰老组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显升高(P＜0.05);何首乌饮预防组、治疗组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显低于衰老组(P＜0.05),何首乌饮治疗组、预防组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:何首乌饮可通过降低β-半乳糖苷酶的表达保护睾丸Leydig细胞衰老损伤.     

保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的扩增及其影响因素

目的 通过扩增得到保加利亚乳杆菌编码高效β-半乳糖苷酶的基因,并探讨影响扩增的因素。方法 采用溶菌酶加冻融法提取细菌DNA;选取不同的模板浓度、退火温度分别进行扩增。结果 模板浓度60ng／μl、退火温度66℃是保加利亚乳杆菌β-乳糖苷酶基因的较优扩增条件。结论 优化了扩增保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶所需的退火温度、模板浓度等条件,提高了扩增产物的产量。     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

Fabry病—家系临床调查及α-半乳糖苷酶A基因突变研究

目的 分析一个Fabry病家系先证者的临床表现,并进行该家系成员α半乳糖苷酶A(GLA)基因突变检测.方法 回顾性分析该家系先证者临床及病理资料,采用聚合酶链式反应(PCR)直接测序法检测先证者及家系成员GLA基因编码序列.结果 ①先证者表现为下肢皮肤色素沉着、神经性疼痛和肾脏损害,其弟死于尿毒症.肾活检提示继发性局灶节段性肾小球硬化,肾小球足细胞泡沫变性,电镜发现足细胞内大量同心圆排列的具有层状结构的包涵体,确诊Fabry病.②GLA基因测序检测发现1个无义突变,位于第2号外显子CAG119TAG(Q119T),终止密码提前出现致使形成一条截短的多肽链.家系发现2例杂合子,分别为先证者母亲及侄女.结论 本研究从生化、病理及基因水平3个层面诊断了一个Fabry病家系,确诊致病原因为GLA基因点突变[第2号外显子CAG119 TAG(Q119T)],该突变在中国人群中首次报道.     

不同年龄大鼠VSMCs培养及衰老相关β-半乳糖苷酶的表达

目的：培养出不同年龄组SD大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,探讨VSMCs复制衰老过程。方法：取出主动脉,0．2％Ⅱ型胶原酶溶液消化分离细胞,培养,按比例1：3传代。免疫细胞化学鉴定平滑肌细胞β-actin。制备老年组、年轻组的第2．6、11代细胞爬片,用SA-β-gal工作液染色,显微镜下计数蓝染细胞阳性,计算衰老细胞率。结果：免疫细胞化学染色显示细胞纯度在95％以上。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色显示随代龄增加,衰老细胞数量增加（P〈0．05）;第6、11代龄,老年组衰老细胞率较年轻组高。结论：1．单纯Ⅱ型胶原酶消化法可以成功培养出不同年龄组大鼠主动脉VSMCs。2．培养的SD大鼠VSMCs表现出复制衰老过程,这可能为探讨细胞衰老及其与年龄相关的疾病机制提供新的视角。     

产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株的筛选、鉴定及酶特性研究

目的 筛选新的产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株,为解决目前工业用β-半乳糖苷酶耗能大、pH要求高的难题创造条件.方法 通过含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的筛选培养基在油田附近土壤中分离纯化菌株并进行鉴定,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物测定酶特性.结果 获得了一株新的产冷活性β-...     

β-半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析

目的构建含ε-NH2标记位点的克隆酶供体免疫分析（CEDIA）系统供体片段。方法从大肠杆菌基因组克隆β-半乳糖苷酶（β-gal）的α片段基因,通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变,与硫氧环蛋白（Trx）融合表达后与Δα片段进行酶学互补活性分析。结果克隆的α片段为β-galN端1-56多肽片段,定点突变得R14K、R53K和R14K/R53K等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上,且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性,其中R53K突变体的活性远高于R14K和R14K/R53K的,且与野生型α片段的基本一致。结论α片段R53K突变体具有作为CEDIA系统含内部标记位点供体的潜力。     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

慢性失神经后衰老相关β-半乳糖苷酶在成年大鼠施万细胞的表达

目的 探讨成年大鼠长时程轴突缺失对大鼠施万细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta galactosidase, SA-β-gal)表达的影响。方法 成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、 1周失神经组、2周失神经组、4周失神经组、5周失神经组、6周失神经组、7周失神经组和8周失神经组。各组动物进行右侧坐骨神经永久性横断手术或者相应的假手术,根据各组设定的远侧段失神经时间分别获取损伤神经的5 mm近侧段和10 mm远侧段以及假手术组同侧神经和手术组对侧神经的对应节段,采用SA-β-gal染色检测SA-β-gal的表达,并对8周失神经组大鼠获取的损伤神经标本用SA-β-gal和施万细胞特异性蛋白（S100β）双标染色分析远侧段神经中SA-β-gal表达的细胞定位。结果 成年大鼠右侧坐骨神经永久横断后,近侧段神经的远端SA-β-gal表达在2周一过性增加,而远侧段神经中SA-β-gal表达在2周明显增加,并且在更长的失神经过程中保持这种高表达水平。而且,绝大部分SA-β-gal的表达出现在S100β免疫反应阳性的施万细胞中。结论 长时程轴突缺失增加成年大鼠施万细胞中SA-β-gal表达。     

嗜热芽孢杆菌β-半乳糖苷酶发酵条件研究

以嗜热芽孢杆菌为菌种,研究发酵生产β－半乳糖苷酶的条件。应用均匀设计法优化发酵培养基组成,结果为（ｇ／Ｌ）：乳糖０．５、蛋白胨２．０、牛肉浸膏２．０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１。在温度５５℃、初始ｐＨ７．０、摇床转速２００ｒ／ｍ ｉｎ 和１０％ 接种量条件下,发酵２４ｈ,β－半乳糖苷酶酶活力达１３．２Ｕ／ｍ Ｌ。在乳糖水解反应中,证实该酶能催化转半乳糖苷反应,合成半乳糖低聚糖。     

Fabry病一家系临床调查及α-半乳糖苷酶A基因突变研究

【摘要】 目的 分析一个Fabry病家系先证者的临床表现,并进行该家系成员α-半乳糖苷酶A（GLA）基因突变检测。方法 回顾性分析该家系先证者临床及病理资料,采用聚合酶链式反应（PCR）直接测序法检测先证者及家系成员GLA基因编码序列。结果 ① 先证者表现为下肢皮肤色素沉着、神经性疼痛和肾脏损害,其弟死于尿毒症。肾活检提示继发性局灶节段性肾小球硬化,肾小球足细胞泡沫变性,电镜发现足细胞内大量同心圆排列的具有层状结构的包涵体,确诊Fabry病。② GLA基因测序检测发现1个无义突变,位于第2号外显子CAG119AG（Q119）,终止密码提前出现致使形成一条截短的多肽链。家系发现2例杂合子,分别为先证者母亲及侄女。结论 本研究从生化、病理及基因水平3个层面诊断了一个Fabry病家系,确诊致病原因为GLA基因点突变〔第2号外显子CAG119AG(Q119)〕,该突变在中国人群中首次报道。     

异常黑胆质成熟剂对D-半乳糖致衰老模型大鼠p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响

目的探讨异常黑胆质成熟剂（ASMq）对D-半乳糖致衰老模型大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响,以此阐明异常黑胆质成熟剂延缓衰老作用的部分机制。方法选取3个月龄雄性 SD 大鼠60只,体质量180～220 g,采用 D-半乳糖制作亚急性衰老模型,随机分为衰老模型组及 ASMq高、中、低剂量组各15只（ASMq高、中、低剂量分别为6．0、3．0、1．5 g·kg-1·d-1）,连续给药21 d。另取15只正常雄性大鼠作为正常对照组。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达。结果各组大鼠心、脑、肝脏组织中 p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达阳性的细胞表现为细胞浆染成黄褐色。与正常对照组比较,衰老模型组心、脑、肝组织中的P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显升高,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）;与衰老模型组比较, ASMq高、中、低剂量组心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显下降,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）。结论 ASMq可降低衰老大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达,从而发挥抗衰老作用。