氯甲基苯甲酰氨标记骨髓间充质干细胞在免疫介导骨髓衰竭小鼠模型体内的归巢

背景：再生障碍性贫血是T淋巴细胞免疫亢进破坏造血干祖细胞的一种异常免疫反应性疾病。骨髓间充质干细胞具有支持造血功能同时具有免疫调控作用。目的：观察骨髓间充质干细胞移植骨髓衰竭模型小鼠体内的归巢情况。方法：将BALB/c小鼠随机分成正常对照组、骨髓衰竭模型组和骨髓间充质干细胞移植组,于第6天将已标记氯甲基苯甲酰氨的BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞经尾静脉注射途径移植给骨髓衰竭模型小鼠,采用流式细胞术和组织学荧光显微镜观察标记细胞在不同组织的动态分布。造模第14天,观察各组小鼠的平均生存时间、外周血血象和骨髓形态学特征。结果与结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注后24h在受体小鼠骨髓中可发现氯甲基苯甲酰氨阳性标记细胞,72h时阳性标记细胞数量增多（P〈0.05）。骨髓间充质干细胞移植组小鼠濒死或处死前的白细胞、血红蛋白、血小板、骨髓单个核细胞数与模型组小鼠濒死时相比显著升高（P〈0.01）。骨髓衰竭模型组比骨髓间充质干细胞移植组平均生存时间短（P〈0.05）。结果证实,骨髓间充质干细胞输入骨髓衰竭模型体内能归巢至骨髓,促进造血恢复,减轻骨髓衰竭程度,显著延长生存时间。     

人骨髓间质干细胞PKH 26荧光标记技术

目的 建立一种PKH26体外荧光标记人骨髓间质干细胞（MSCs）的方法。方法 培养人骨髓间质干细胞，按PKH26标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析，观察标记后人MSCs生长状态、荧光强度变化和传代培养效果。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）等方法观察标记细胞的生物学功能。结果 标记后MSCs呈红色荧光，标记率达100％，体外连续传代培养7代后，荧光标记细胞荧光强度逐渐减弱，荧光标记细胞百分比逐渐减低。PKH26标记MSCs的生长形态、生长活力、nucleostemin、三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因表达及体外诱导分化能力等生物学特性不发生改变。结论 PKH26荧光标记人MSCs是一种有效、实用的方法，该方法对MSCs转归、可塑性及MSCs移植治疗研究具有重要的价值。     

人骨髓间质干细胞的体外菲立磁标记

背景: 常规干细胞示踪的检测方法,需取实验动物组织进行检查,缺乏示踪的动态检测和无创性.目的: 通过体外菲立磁标记骨髓间质干细胞并进行磁共振成像扫描,明确不同浓度菲立磁对人骨髓问质干细胞细胞活性的影响和检测菲立磁标记的最佳浓度,并筛选出适合人骨髓间质干细胞磁共振成像扫描的成像序列.方法: 使用不同质量浓度菲立磁(100,50,25,12.5 mg/L)与生长状态良好第3代人骨髓间质干细胞孵育24～48 h,另设未进行标记的第3代细胞为空白对照组.两组细胞进行四甲基偶氮唑蓝法检测增殖生长情况并描绘生长曲线.细胞普鲁士蓝染色鉴定人骨髓间质干细胞的标记情况.进行磁共振成像检测,确定最佳磁共振成像序列.结果与结论: 质量浓度≤25 mg/L的菲立磁标记对人骨髓间质干细胞的增殖能力不会产生影响,并且以25 mg/L的标记效果最佳.而≥50 mg/L的菲立磁标记则明显抑制人骨髓间质干细胞的增殖.磁共振成像扫描显示菲立磁标记24,48 h或子代的人骨髓间质干细胞标本T1WI、T2WI以及T2*WI 3个序列上均可见信号降低,以T2*WI变化最为明显.证实菲立磁可用于体外标记人骨髓间质干细胞连续性研究.菲立磁标记对人骨髓间质干细胞增殖能力的影响存在浓度相关性,25 mg/L为最佳标记浓度.磁共振成像T2*WI序列更适合追踪菲立磁标记的人骨髓间质干细胞.     

PKH-26标记骨髓间充质干细胞气管移植的体内示踪

背景:PKH-26已经被成功应用于标记骨髓间充质干细胞并进行体内示踪。目的:通过气管移植合并静脉移植PKH-26标记的骨髓间充质干细胞评价PKH-26的示踪效果,并检测骨髓间充质干细胞在体内向受损组织的迁移情况。方法:用贴壁法进行骨髓间充质干细胞的原代细胞培养,以PKH-26标记3～5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入气管移植的受体大鼠体内,用等量的PBS注射作为实验对照。结果与结论:用PKH-26进行细胞骨髓间充质干细胞标记后,荧光显微镜下观察可见几乎所有骨髓间充质干细胞均有红色荧光。移植后8周仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记。远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。结果表明骨髓间充质干细胞经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定植,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定植于移植段气管。PKH-26的红色荧光标记稳定性高,是可应用于长期观察的无降解的荧光标记物。     

PKH-26标记骨髓间充质干细胞气管移植的体内示踪

背景：PKH-26已经被成功应用于标记骨髓间充质干细胞并进行体内示踪。目的：通过气管移植合并静脉移植PKH-26标记的骨髓间充质干细胞评价PKH-26的示踪效果,并检测骨髓间充质干细胞在体内向受损组织的迁移情况。方法：用贴壁法进行骨髓间充质干细胞的原代细胞培养,以PKH-26标记3～5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入气管移植的受体大鼠体内,用等量的PBS注射作为实验对照。结果与结论：用PKH-26进行细胞骨髓间充质干细胞标记后,荧光显微镜下观察可见几乎所有骨髓间充质干细胞均有红色荧光。移植后8周仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记。远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。结果表明骨髓间充质干细胞经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定植,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定植于移植段气管。PKH-26的红色荧光标记稳定性高,是可应用于长期观察的无降解的荧光标记物。     

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。     

经静脉移植的人源骨髓间质干细胞在心梗大鼠体内的分布

目的:通过观察人源骨髓间质干细胞经外周静脉移植后在心梗大鼠体内的动态分布情况,初步评价其治疗急性心肌梗死的可行性和安全性。方法:采集人源骨髓干细胞行体外扩增,结扎大鼠冠脉左前降支制备心梗模型,72 h后分别经正常、假手术及心梗大鼠尾静脉注射BrdU标记的干细胞1×106,移植术后3d和30d ,用免疫组化法观察移植细胞在心、肺、肝、脾的分布及变化。结果:移植术后,归巢梗死心脏的移植细胞数量均显著多于非梗死心脏(P<0.01)。术后3d,标记细胞优先归巢至心脏梗死区,周围缺血区次之,而远离梗死区及其它部位甚少;术后30d,梗死区移植细胞减少,而周围缺血区无明显变化,且略多于前者。结论:人源骨髓间质干细胞经外周静脉移植可作为急性心梗治疗的另一条可行、安全途径。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景：目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。 目的：建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。 方法：取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。 结果与结论：用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞, CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。     

Gd-DTPA标记骨髓间质干细胞在脊髓损伤模型中的磁共振示踪研究

目的 探讨用钆-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)用于细胞示踪的可行性.方法 用jetPEITM-FluoF结合Gd-DTPA形成顺磁性颗粒,标记MSCs,电镜观察标记情况,并用MTT法测定标记细胞的活力.对标记的细胞进行体外和大鼠脊髓内磁共振成像(MRI).结果 Gd-DTPA可高效标记MSCs,同时对MSCs生长无影响.体外及MSCs移植大鼠脊髓损伤模型MRI T1wI均显示,标记细胞呈高信号强度.结论 Gd-DTPA成功标记的MSCs在体外和大鼠脊髓组织内均可检测到明显的MRI信号强度改变.Gd-DTPA可以用于MSCs标记的MRI示踪.     

骨髓间质干细胞

培养中的MSCs易于粘附到塑料瓶壁上。利用这一特点可以将MSCs与其它细胞分开。这些细胞有干细胞的特征,能向多种骨髓基质细胞分化。MSCs可用于细胞移植,或作为基因治疗的载体。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子和CM-DiI荧光双标记骨髓间充质干细胞

背景:细胞移植疗效监测取决于有效的标记方法,从而能够对移植细胞进行示踪.超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide,SPIO)是一种较为理想的新型磁共振对比剂,用SPIO标记细胞可实现对移植细胞进行活体示踪.而荧光活性染料CM-Dil无细胞毒性,不影响细胞的生长,适合标记和示踪细胞.目的:观察SPIO及CM-Dil对骨髓间充质干细胞的标记及示踪效果.方法:全骨髓法培养猪骨髓间充质干细胞,用含50 mg/L铁浓度的SPIO及CM-Dil标记骨髓间充质干细胞,将双标后的骨髓间充质干细胞经冠状动脉注入猪心肌梗死模型.4周后取心脏组织行冰冻切片观察.结果与结论:SPIO及CM-Dil在体外标记骨髓间充质干细胞效率高,几乎达100%.经冠状动脉移植4周后心肌组织可找到双标记的骨髓间充质干细胞,结果提示SPIO及CM-Dil双标记骨髓间充质干细胞体内示踪效果好.     

CM-Dil体外标记人脐带间充质干细胞传代示踪的可行性

背景: 掌握人脐带间充质干细胞的移植示踪方法是研究其生物学特性的关键.目的: 观察用CM-Dil标记人脐带间充质干细胞及在体外传代示踪的可行性.方法: 采用酶消化法体外分离培养人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期、体外成脂成骨诱导鉴定该细胞.将第5代细胞用CM-Dil标记,并将细胞传代,荧光显微镜观察体外标记情况.结果与结论: 第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34、CD40;有80%以上的细胞处在G0/G1期,成脂成骨诱导后,油红O染色和碱性磷酸酶染色分别阳性.CM-Dil标记人脐带间充质干细胞细胞标记率达90%以上,体外传代后荧光强度逐渐减退,传8代后,荧光基本消失.说明人脐带间充质干细胞增殖、分化能力强,CM-Dil标记细胞示踪方法简单易行.     

循环骨髓间充质干细胞在体内的分布

目的:骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能,进入循环的间充质干细胞在体内的分布对其应用有重要意义,本文综述其分布特点及机制的研究。资料来源:应用计算机检索Pubmed、OVID数据库1999-01/2006-06与间充质干细胞分布有关的文献,检索词为"bonemarrow mesenchymal stem cells,distribution,homing,infuse,transplant"。应用计算机检索清华全文数据库2000-01/2006-06相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞,分布,归巢,移植"。资料选择:对资料进行初审。纳入标准:①骨髓间充质干细胞移植的研究。②骨髓间充质干细胞归巢和体内分布相关的文献。排除标准:重复性研究、综述。资料提炼:共检索与骨髓间充质干细胞移植和在体分布有关文献128篇,最后符合纳入标准的37篇。资料综合:循环的骨髓间充质干细胞分布部位广泛,分布在损伤的骨髓、心肌、肺、脑、皮肤、肝脏、肾等重要脏器。全身放射性损伤后具有向损伤部位分布的规律,并且对于某些脏器存在倾向性。影响其分布特点可能与组织器官的血管分布和血流动力学特点、血管通透性、靶部位表达和释放趋化骨髓间充质干细胞因子、骨髓间充质干细胞自身表型的改变有关。结论:进入循环的间充质干细胞在体内分布有向某些器官和部位的倾向性,并且有向损伤部位靶向分布的特点,这与器官组织结构和间充质干细胞本身特点有关,机制有待进一步阐明。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的:国内外对骨髓间充质干细胞体外成功诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜,但这些诱导方法都比较繁琐,而且大多都应用了细胞因子.实验拟验证体外非细胞因子方法诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法:实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心,校一级实验室完成.①实验材料:4～6周龄Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下取大鼠的骨髓细胞,并通过贴壁时间差异性去除单核细胞从而获得骨髓干细胞.应用二甲基亚砜及高糖环境依次对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外诱导,以直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基培养的为对照.③实验评估:通过形态、双硫腙染色、免疫组织化学及RT-PCR方法对诱导后的细胞进行检测,采用ELISA方法对诱导后细胞分泌的胰岛素进行检测. 结果:①培养10 d时,诱导组细胞呈细胞团样改变,内层的细胞为圆形,外层的细胞呈长梭形并包绕着内层细胞.对照组细胞也呈团样改变,但形态不规则,呈发散状,细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞.②诱导组的细胞团双硫腙染色后呈明显猩红色,对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色.③诱导组成团及单个存在的圆形和梭形细胞中有胰岛素存在,对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在.④在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下,诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2,对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2.⑤ELISA法证实诱导后细胞向胞外分泌胰岛素,与对照组比较差异显著(P < 0.05).结论:大鼠骨髓间充质干细胞体外经过二甲基亚砜和高糖环境诱导可分化为胰岛素分泌细胞.     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.     

骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展

背景：骨髓间充质干细胞标记及示踪技术是干细胞移植治疗的研究热点之一。虽然近几年骨髓间充质干细胞标记及示踪技术有了很大进展,但仍存在很多问题有待进一步解决。目的：对国内外骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展作一综述。方法：应用计算机检索CNKI和Foreign Medical Journal Service数据库中1982-01/2011-10关于骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的文章,在标题和摘要中以＂骨髓间充质干细胞;标记方法;示踪技术＂或＂bone marrow,labeling,Tracer＂为检索词进行检索。最终选择29篇文献进行综述。结果与结论：骨髓间充质干细胞的示踪技术众多,主要有同位素示踪法、抗原标记法、荧光蛋白标记法、荧光染料标记法、核磁共振对比增强剂标记法、Lac-Z基因标记法、Y染色体标记法。每一种方法都有其优缺点,选择的标记方法应具有特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、标记和检测方法简单易行、标记时间合适等特点。种子细胞的示踪技术仍需要进一步深入研究。