密度梯度离心法分离和纯化视网膜色素上皮细胞

目的 观察密度梯度离心法分离、纯化原代及传代视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的效果。 方法 将原代及传代后仍有成纤维细胞污染的人RPE细胞分别各分为实验组和对照组，实验组用聚蔗糖(ficoll) 泛影葡胺(ficoll hypaque, F／H )（d=1.077 g/ml）进行等密度梯度离心分离，对照组用常规离心分离纯化 ，0.4％台盼蓝拒染活细胞计数；抗人细胞角蛋白（cytokeratin，CK）间接免疫荧光染色, 流式细胞术分析；荧光显微镜观察细胞形态；观察细胞的生长状态和初步克隆形成率；共聚焦显微镜观察细胞纯化结果及其生长状态。 结果 实验组细胞存活率均高于对照组（P＜0.00 1），但是细胞数量减少；流式细胞术分析结果显示实验组CK阳性细胞率高于对照组（P＜0.001）；ficoll 离心组涂片细胞呈圆形，边界清晰，荧光染色均匀，活力好；实验组RPE细胞形态较均一，贴壁时间短，进入分裂期快，初步细胞克隆形成率高于对照组（P＜0.001）；爬片生长的RPE细胞CK阳性细胞率两组组间比较差异有显著性的意义（P均<0.001）。 结论 ficoll 密度梯度离心法分离的RPE细胞形态均一，生长一致性好，进入细胞倍增期时间短，细胞活力保持好；细胞纯化效果较好。 （中华眼底病杂志，2003，19：333-404）     

细胞因子对培养的人视网膜色素上皮细胞胶原合成的影响

目的 观察转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)和干扰素γ(interferon-gamma,IFN-γ)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)胶原合成的影响。 方法 用³Ｈ-脯氨酸掺入、免疫细胞化学及分子杂交技术观察TGF-β和IFN-γ分别及联合作用下培养的人RPE胶原合成活性。 结果 TGF-β在10 ng/ml浓度使RPE对³Ｈ-脯氨酸的摄取增加130.87％,并增强Ⅳ、Ⅰ和Ⅲ型胶原荧光染色和mRNA表达。IFN-γ在10 000 U/ml浓度抑制54.72％的脯氨酸摄取,并减弱Ⅳ型胶原染色和3种胶原的mRNA表达。 结论 TGF-β和IFN-γ对RPE的胶原合成分别具有正向及负向调控作用,IFN-γ可能用于抑制RPE胶原合成。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 245-248)     

视网膜色素上皮细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡是由遗传基因调控的细胞主动死亡形式,具有不同于细胞坏死的典型特征,越来越多的证据表明,视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡参与了许多眼底疾病的发生发展。阐述了RPE细胞凋亡的形态学特点,生物化学特征、遗传基因调控以及活性氧自由基在其凋亡过程中所起的作用。     

兔虹膜和视网膜色素上皮细胞的体外培养比较

目的 观察比较有色素兔虹膜色素上皮(IPE)及视网膜色素上皮(RPE)细胞的体外生长状况。方法 采用酶消化法及酶辅助机械分离法分别分离IPE和RPE细胞。观察培养的两种细胞的生长状况，并对其进行免疫组化鉴定。结果 原代IPE及RPE细胞大多呈圆形或六边形，细胞内充满了黑色素颗粒。随着传代的增加，呈梭形或纤维细胞样生长的细胞增多，细胞中的色素颗粒也逐渐减少。细胞角蛋白免疫组化染色显示IPE及RPE细胞绝大多数呈棕黄色阳性反应。Desmin兔疫组化染色显示IPE细胞中阳性细胞约占5％。结论 分离培养的IPE和RPE细胞纯度很高。IPE细胞中绝大多数为后层IPE细胞。IPE和RPE细胞的形态及体外生长特点类似。     

氧自由基诱导培养的牛视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

为进一步从细胞和分子水平研究视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）细胞氧化损害的机制,为临床防治与ＲＰＥ细胞相关眼病提供理论依据,我们对氧化损伤的牛ＲＰＥ细胞是否存在着凋亡以及ｐ５３基因表达水平的变化等进行了研究。...     

低温冷冻后的人视网膜色素上皮细胞释放促细胞增殖物质

视网膜色素上皮（ＲＰＥ）能合成及释放多种生长因子,冷凝作为一种外界刺激因素,可使静息状态的ＲＰＥ细胞转化为活性细胞,使其具有释放功能。以往的研究多是应用动物实验和视网膜脱离患者视网膜下液中成分分析而间接推测的结果,直接对ＲＰＥ细胞冷冻,测定促细胞增殖...     

维拉帕米体外诱导人视网膜色素上皮细胞的凋亡

目的:探讨维拉帕米诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡的有效作用浓度和时间。方法:采用HE染色﹑AO荧光染色和透射电镜以及流式细胞仪检测80和160mg/L维拉帕米作用12￣72h致凋亡作用。结果:80和160mg/L维拉帕米均可诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡。经统计学分析其差异具有显著性,且具有明显的时间—剂量关系,160mg/L维拉帕米作用72h时,凋亡率最高达49.3%。结论:维拉帕米能诱导体外培养的人RPE细胞凋亡。     

视网膜色素上皮细胞的凋亡和预防

视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的凋亡在许多视网膜疾病的发生发展中起着重要作用,近年来,随着人们对细胞凋亡研究的进一步深入,对于细胞凋亡的发生机制有了更深的了解,本文阐述了RPE细胞的功能;同时对导致RPE细胞凋亡的可能机制、RPE细胞凋亡的预防作一综述.     

视网膜色素上皮细胞凋亡机理的探讨

了解诱导视网膜色素上皮细胞在体外发生凋亡的以推测该细胞凋亡在体内发生的可能机理。方法培养的人ＲＰＥ细胞分别给予低氧，肿瘤坏死因子，蛋白激酶抑制剂及抗Ｆａｓ抗体处理２４－７２ｈ，同时也观察了纤维母细胞生长因子对体外凋亡诱导因子所致ＲＰＥ细胞凋亡的保护作用。     

视网膜色素上皮细胞凋亡相关疾病的治疗现状及展望

细胞凋亡是生理或病条件下的一种由遗传基因控制的基础主动死亡形式,对维持机体的正常发育以及内环境的稳定起重要作用。细胞凋亡平衡的破坏可导致多种疾病的发生发展。现介绍基因治疗、细胞因子或生长因子、视网膜移植对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE)细胞凋亡所致疾病的治疗现状及前景。     

维甲酸诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的 研究维甲酸(rentinoic acid,RA)诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithlium,RPE)细胞凋亡特征。 方法 体外培养的RPE细胞中加入10-^5_、10^-6_、10^-7mol/L RA,应用吖啶橙荧光染色和核苷酸末端转移酶介导的dUIP末端标记法(Tdt-mediated dUIP nick end labelling method,TUNEL法)观察凋亡细胞。 结果 10^-5、10^-6、10^-7mol/L RA诱导RPE细胞凋亡,凋亡细胞表现为细胞固缩,染色质聚.TUNEL法显示凋亡细胞DNA片断化.10^-7、10^-6、10^-5mol/L RA作用5天时,凋亡指数分别为36.9、44.9%、61.4%。作用6天时，凋亡指数分别为48.0%、59.9%、74.2%。经统计学处理,同一RA浓度时,随作用时间延长凋亡指数增加;同一作用时间时,随RA浓度增大凋亡指数增加,差异有显著性(P<0.05). 结论 RA能诱导RPE细胞凋亡，且有很好的时间剂量效应。(中华眼底病杂志,1998,14:153-155)     

白介素1受体拮抗剂抑制视网膜色素上皮细胞炎前因子的表达

目的　观察视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞白细胞介素 6 (inter-leukine 6 ,IL - 6 )和白细胞介素 8(interleukine 8,IL - 8)的表达及白细胞介素 1受体拮抗剂 (interleukine 1receptor antigonist,IL- 1ra)对 RPE细胞 IL- 6和 IL- 8表达的影响。　方法　培养的人 RPE细胞分为对照组和 IL - 1ra组 (IL - 1ra,1、10、10 0 ng/ ml) ,用酶联免疫吸附、免疫组织化学和原位杂交等方法观察 RPE细胞 IL- 6和 IL- 8的表达。　结果　对照组 RPE细胞培养上清液中 IL- 6、IL- 8分别为 2 0 0 0、5 0 0 0 pg/ ml。与对照组比较 ,IL - 1ra组 IL - 6、IL - 8分别为 30 0 pg/ ml(t=8.0 11,P <0 .0 1)、4 5 0 pg/ ml(t=11.4 4 6 ,P<0 .0 1)。经白细胞介素 1β(interleukine1β,IL- 1β)刺激后 RPE细胞 IL- 6和 IL- 8m RNA表达原位杂交表现为细胞浆中浓淡不一的蓝色着色 ,IL - 1ra作用组细胞染色较淡。　结论　在 IL - 1β刺激下 ,培养的人 RPE细胞可以表达 IL- 6、IL- 8的 m RNA和蛋白质 ,IL- 1ra能有效抑制其 IL- 6、IL- 8m RNA和蛋白质的表达     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

玻璃体液诱导视网膜色素上皮细胞间质转分化作用

目的 观察人玻璃体液体外培养诱导人视网膜色素上皮(RPE)细胞间质转分化作用.方法 将3～5代传代人RPE细胞分为普通培养组和玻璃体液培养组,分别应用普通培养液和25％玻璃体液进行培养.采用相差显微镜观察两组细胞形态变化,细胞爬片检测肌动蛋白细胞骨架的变化.分别用细胞划痕法、Transwell小室侵袭法及Ⅰ型胶原凝胶收缩实验检测细胞迁移、侵袭及收缩力的变化.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Snail1 mRNA的表达.结果 相差显微镜观察发现,普通培养组细胞保持扁平形态,细胞接触广泛;玻璃体液培养组细胞一端呈扇形,另一端呈锥形拖尾形或梭形,细胞生长呈彼此分离的方式.细胞爬片结果显示,普通培养组肌动蛋白骨架主要分布于RPE细胞周边部,形如细胞周边的条带状;玻璃体液培养组肌动蛋白纤维在细胞的一端重排,形成扇形扁平状伪足突起,而在细胞另一端形成锥形拖尾改变.玻璃体液培养组与普通培养组比较,RPE迁移及侵袭能力显著增强(t=14.190、22.630)、细胞收缩能力显著下降(t=6.221),差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,玻璃体液培养组与普通培养组比较,Snail1 mRNA表达显著上升(t=3.218,P=0.032),α-SMA mRNA表达显著下降(t=3.990,P=0.016),差异均有统计学意义.结论 玻璃体液培养可诱导RPE细胞间质转分化.这一作用通过增强RPE细胞迁移及侵袭能力,抑制RPE细胞收缩力;提高RPE细胞Snail1 mRNA表达,下调α-SMA mRNA表达实现.     

体外培养的猪眼色素上皮细胞屏障功能的研究

目的 研究体外培养的猪眼视网膜色素上皮（RPE）细胞的血视网膜外屏障功能。 方法 对猪眼RPE细胞进行原代培养，第3代细胞接种于微孔滤器，微孔滤器的滤膜为无聚乙烯吡咯酮（PVP）聚碳酸脂膜（polycarbonate），分别于培养1、2、3、4周对滤膜表面行光学显微镜观察，于培养后2周对膜切面行光学显微镜和透射电子显微镜观察;行跨膜电阻测定并用荧光素钠和辣根过氧化物酶（HRP）进行通透性检测。 结果 成功原代培养了猪眼RPE细胞。光学显微镜观察结果显示，RPE细胞接种1周后，细胞基本汇合，接种后2、3周时RPE细胞密度无明显变化，接种后4周时细胞密度下降;滤膜及细胞标本切面观察结果显示，RPE细胞可在滤膜表面表现出单层有极性生长的特性;接种于微孔滤器2周后，RPE细胞跨上皮细胞电阻达（97.44±11.36） Ω/cm2，并至少持续到接种后3周;通透性检测结果显示，孵育30 min后只有0.27%的荧光素钠和0.17%的HRP从滤膜上方到达下方，分子量小的荧光素钠比分子量大的HRP通透率高。 结论 应用无PVP聚碳酸脂膜的微孔滤器可以建立体外RPE细胞有极性单层生长的模型，并用于屏障功能的研究。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 188-191)     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

目的 探讨Y27632在体外诱导成人视网膜色素上皮(RPE)细胞转分化为神经元样细胞的可行性.方法 取生长良好的第3～6代成人RPE接种于6孔培养板,细胞贴壁生长后分为对照组和实验组.对照组培养基为2%胎牛血清(FBS)+Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12培养液,实验组在此培养基中加入10 μmol/L Y27632.于诱导3、6 h和1、3、5、7 d观察细胞形态,并用细胞免疫荧光染色法鉴定诱导后3 d对照组和实验组角蛋白CK18、微管相关蛋白Map2、神经丝蛋白NF200、Pax6的阳性表达率,两组间的比较采用x2检验.结果 实验组经诱导后RPE细胞发出轴突样突起并相互连接成网状,呈现典型的神经元细胞形态,占50.1%.对照组RPE和实验组细胞角蛋白表达阳性率分别为93.97%和43.88%,两组比较差异有统计学意义(x2=64.763,P＜0.01);Map2对照组和实验组阳性率分别为4.49%和31.90%,两组比较差异有统计学意义(x2=23.634,P＜0.01);NF200对照组阳性表达率为22.37%,但阳性表达细胞形态为类圆形,实验组阳性率表达为57.45%,大量细胞发出轴突样突起,两组比较,差异有统计学意义(x2=21.261,P＜0.01);Pax6对照组和实验组细胞阳性率分别为8.33%和65.79%,两组比较,差异有统计学意义(x2=25.946,P＜0.01).结论 Y27632体外诱导成人RPE细胞出现神经元样细胞,是一种可行的诱导方法.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

体外光动力疗法致血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

目的 研究体外光动力疗法（PDT）诱导的血管内皮细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡情况。 方法 将体外培养的血管内皮细胞和人RPE细胞与血药浓度（1.0 μg/ml）相当的光敏剂verteporfin共同孵育，根据孵育时间的不同，每种细胞分成6组：0、5、15、30、60、120 min组。孵育至上述时间后，分别用光敏剂最大吸收波长光照（689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光），能量密度为2.4 J/cm2，光照时间为83 s。用流式细胞仪检测3 h后各组细胞凋亡比例，实验重复进行3次。 结果 PDT后3 h，血管内皮细胞在6组的凋亡比例分别为：0.01±0.01、0.25±0.02、0.32±0.02、0.41±0.04、0.49±0.03和0.61±0.02；RPE细胞各组的凋亡比例分别为：0.02±0.01、0.22±0.01、0.31±0.02、0.38±0.03、0.47±0.05和0.58±0.03；两种细胞的凋亡比例均随细胞与光敏剂孵育时间的延长而增加；两种细胞在相同时间组的凋亡比例经t检验差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 PDT可致RPE细胞和血管内皮细胞快速凋亡，在相同的体外环境下，PDT对两种细胞所诱导的凋亡反应无明显选择性。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 253-255)     

人视网膜色素上皮细胞与T淋巴细胞的激活

目的 观察人视网膜色素上皮（RPE）细胞人类白细胞抗原(HLA)-DP、-DQ、-DR抗原和CD40抗原的表达，以确定它们在免疫应答过程中的分子表达和刺激T淋巴细胞活化的能力。方法 人RPE细胞分别在γ-干扰素诱导和无诱导的条件下培养，免疫组织化学染色方法测定HLA-DP、-DQ、-DR抗原和CD40抗原在RPE细胞中的表达。体外共同培养人RPE细胞和外周血单个核细胞，荧光活化细胞分类仪测定其中活化的T淋巴细胞CD69的表达。结果 γ-干扰素能够诱导HLA-DP、-DQ、-DR抗原表达升高和CD40在人RPE细胞上的表达，CD69阳性的T淋巴细胞，在人RPE细胞与外周血单个核细胞的共同培养系统中的含量增加。结论 人RPE细胞能够激活外周血中T淋巴细胞，是一种具有免疫学特性潜能的抗原递呈细胞。     

Bax过表达诱导培养的人视网膜色素 上皮细胞凋亡观察

目的研究外源性促凋亡基因bax过表达对培养人的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium ,RPE）细胞凋亡的影响。 方法通过脂质体Lipofectin介导法用含人全长bax 基因片段的真核表达载体P^MDNA3-hbax质粒转化体外培养的RPE细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,提取实验组细胞DNA进行DNA梯度电泳。结果Zn^2+可诱导P^MDNA3-hbax转化组RPE细胞出现明显的凋亡峰 ,凋亡峰位于单倍体和二倍体之间,凋亡率为36%,DNA电泳可见DNA梯状条带,P^MDNA3空载体组及未转染组RPE细胞未见亚二倍峰和DNA梯状条带出现。结论外源性促凋亡基因bax过表达可诱导RPE细胞凋亡。(中华眼底病杂志,2001,17:132-134)