介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP功能肽段在E．coli中的可溶性表达及功能

目的：将介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP的重要功能肽段与GST蛋白在大肠杆菌中融合表达．方法：利用合成的特异性引物钓取金黄色葡萄球菌基因组中的目的片段,将其克隆人pGEX—KG载体,在大肠杆菌中与GST蛋白进行融合表达．结果：成功地表达了目的肽,可溶性的表达产物占细菌可溶性蛋白的20％左右,且目的肽与配基纤连蛋白Fn具有结合的能力．结论：成功地表达了介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP中的重要功能肽段,为研究金葡菌侵袭细胞的机制奠定了基础．     

缺氧共培养血管内皮细胞对绒毛外滋养细胞侵袭力的影响

目的 探讨在缺氧共培养条件下血管内皮细胞对绒毛外滋养细胞侵袭力的影响.方法 绒毛外滋养细胞在缺氧下单独培养作为对照组,绒毛外滋养细胞与血管内皮细胞用Transwell小室建立缺氧共培养作为观察组.应用荧光定量PCR、Western blot方法分别检测绒毛外滋养细胞基质金属蛋白酶9(MMP9)/基质蛋白酶抑制剂1(TIMP1)mRNA及蛋白的表达;应用Transwell侵袭模型检测缺氧共培养下绒毛外滋养细胞侵袭力的变化.结果 与对照组比较,观察组的绒毛外滋养细胞MMP9 mRNA及蛋白的表达均明显降低(均P＜0.01),TIMP1 mRNA及蛋白的表达无明显变化(均P＞0.05);观察组的绒毛外滋养细胞侵袭力较对照组明显降低(P＜0.01).结论 缺氧共培养条件下,血管内皮细胞可下调绒毛外滋养细胞MMP9基因的表达并降低绒毛外滋养细胞侵袭力.     

小RNA SbfR增强伤寒沙门菌动力和侵袭力

目的: 探究小RNA SbfR对伤寒沙门菌动力和侵袭力的影响及其潜在机制。方法: 用前期构建的SbfR缺陷株（△SbfR+pBAD/Myc HisA）、SbfR回补株（△SbfR＋pBAD/Myc HisA SbfR）和空载体株（WT+pBAD/Myc HisA）进行细菌动力实验和HeLa细胞侵袭实验,观察SbfR对伤寒沙门菌的动力和对HeLa细胞侵袭力的影响。通过基因芯片分析SbfR缺陷株与回补株全基因组表达的差异,并进一步用qRT PCR分析SbfR对2个鞭毛和2个侵袭相关基因的调控作用。结果： 与空载体株、SbfR回补株比较,SbfR缺陷株动力和侵袭力均明显下降（P＜0.01或0.05）;缺陷株鞭毛和侵袭相关基因的转录表达水平均比回补株明显下降（均P＜0.05）。 结论： SbfR通过促进鞭毛和侵袭相关基因的表达,增强伤寒沙门菌的动力和侵袭力。     

口腔癌相关成纤维细胞侵袭特性研究

目的采用体外重建基底膜细胞侵袭实验,研究口腔癌相关成纤维细胞（Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）侵袭力,用免疫组织化学法,观察CAFs对相关蛋白的表达。探讨CAFs在口腔鳞癌中的病理意义。方法采用组织块贴壁法培养颊部正常成纤维细胞（Normal Fibroblasts,NFs）和癌相关成纤维细胞CAFs,利用包被matrigel的transwell小室模拟天然基底膜的结构,利用培养基浓度梯度差诱导细胞穿膜并计数穿膜细胞数量,比较CAFs和NFs的侵袭力差异。采用免疫组化法,比较CAFs和NFs对基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotease-2,MMP-2）和成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein,FAP）表达差异。结果 CAFs穿膜的细胞数量显著高于NFS（P〈0.05）,差异具有统计学意义。CAFs对MMP-2和FAP的蛋白表达阳性,NFs表达为阴性。结论口腔CAFs的体外侵袭能力明显高于NFs,且能特异性地分泌MMP-2和FAP蛋白。这提示肿瘤间质的侵袭特性可随着上皮癌变而同步激活,CAFs参与肿瘤细胞外基质的重建,与肿瘤侵袭转移有关。     

高侵袭力人胃癌细胞亚系MKN-28s的建立

目的以穿透人工基底膜的能力大小为依据筛选具有体外高侵袭能力的胃癌细胞亚系。方法用体外培养法收集扩增能侵袭穿透人工基底膜的胃癌细胞亚系;比较母亚两系的侵袭能力;流式细胞术检测母亚两系细胞周期;免疫组织化学SP法观察母亚两系细胞Flt-4蛋白表达情况。结果从母系MKN-28中成功筛选出高侵袭力胃癌细胞亚系MKN-28S;显微镜下细胞计数示亚系侵袭至膜背面的数量较母系明显增多（P〈0.05）,细胞侵袭力增强;亚系中Flt-4蛋白表达同母系相比显著增高;亚系增殖指数（PI）高于母系。结论MKN-28S细胞较MKN-28细胞具有更强体外侵袭力和增殖能力。     

金黄色葡萄球菌对U937细胞HSP90蛋白表达的影响

目的探讨金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡以及热休克蛋白90（HSP90）在这一过程中的作用。方法当U937：金葡菌分别为0,1∶5,1∶10,1∶20,1∶50和1∶100时,培养30min;当U937：金葡菌为1∶20时,分别培养0,15,30,60和90min。采用Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测U937细胞凋亡率;采用Western blot方法检测HSP90蛋白的表达。结果U937细胞凋亡率随着金葡菌浓度的增加及感染时间的延长而逐渐增高;HSP90的表达随着金葡菌浓度的增加及感染时间的延长而逐渐升高。结论金葡菌诱导的U937的凋亡可能与HSP90蛋白表达的改变有关,并且具有感染时间及细菌浓度依赖性。     

灵芝三萜组分GLE对人鼻咽癌细胞CNE2侵袭转移的影响

目的研究不同浓度灵芝三萜组分GLE对人鼻咽癌细胞CNE2侵袭转移的影响及其作用机制。方法 CNE2细胞体外培养,经10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL GLE分别处理1h、24h及48h,细胞黏附实验检测细胞黏附能力,细胞迁移实验检测细胞运动能力,细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力。应用蛋白免疫印迹法检测侵袭转移相关蛋白的表达。结果不同浓度GLE与对照组比较,GLE能有效抑制CNE2细胞的黏附力、运动力和侵袭力(P0.05),且能下调CNE2细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结论 GLE抑制CNE2细胞的浸润转移能力,其机制可能与下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达使CNE2细胞的黏附力、运动力和侵袭力下降有关。     

金葡菌及其L型对小鼠胸腺细胞凋亡的影响

目的:研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)及其L型(金葡菌L型)对小鼠胸腺细胞凋亡的影响.方法:用金葡菌、金葡菌L型、肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)分别作用于小鼠胸腺细胞,同时设立正常对照,于作用后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h终止培养.Anninix V和PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:SEB作用2 h、金葡菌作用4 h、金葡菌L型作用6 h后各时间段小鼠胸腺细胞的凋亡率与对照组比较均明显增高(P<0.01),随着诱导时间的延长,胸腺细胞的凋亡率逐渐增加(P<0.01);SEB诱导胸腺细胞凋亡率在6 h、8 h和10 h时均明显弱于原菌(P<0.01). 结论:金葡菌L型和原菌以及SEB均能促进胸腺细胞凋亡,除SEB外,产SEB金葡菌株及其L型诱导胸腺细胞凋亡还可能有其他因素参与.     

金葡菌对人巨噬细胞系U937细胞Fas/FasL表达的影响

目的探讨金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡时Fas/FasL蛋白的表达及意义。方法当细胞∶细菌为1∶20时分别培养0,15,30,60和90min,采用Western blotting检测Fas/FasL蛋白的表达情况,应用SPSS10.0软件包对结果进行统计学分析。结果Fas/FasL蛋白的表达随着金葡菌感染时间的延长而增高。结论金葡菌能够上调Fas/FasL蛋白的表达,从而可以诱导U937细胞的凋亡。     

siRNA干扰CXCR4基因对T24细胞侵袭力的影响

目的:研究RNA干扰下调CXCR4基因对膀胱移行细胞癌T24细胞体外侵袭力的影响。方法:根据CX-CR4基因特点,设计合成CXCR4特异性小干扰RNA(siRNA),并转染T24细胞,同时设置空白对照(转染时只加脂质体)和阴性对照(采用无关序列RNA转染)组。通过RT-PCR方法检测CXCR4mRNA的表达,采用Westernblot方法检测CXCR4蛋白的表达,用Boyden小室体外细胞侵袭模型检测细胞体外侵袭能力。结果:各组T24细胞的CXCR4mRNA、蛋白水平和穿膜细胞数比较,差异有统计学意义(F=140.822、473.079和133.247,P<0.001)。siRNA转染组T24细胞的CXCR4mRNA、蛋白表达下调,体外侵袭力减弱(P<0.05)。结论:CXCR4特异性siRNA可降低膀胱移行细胞癌T24细胞体外侵袭力。     

金黄色葡萄球菌对人脐静脉内皮细胞、人羊膜细胞细胞骨架重排及其诱导凋亡的作用

目的 探讨金黄色葡萄球菌(S.aureus)入侵人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人羊膜细胞(WISH)细胞骨架微丝、微管变化及其诱导细胞凋亡作用.方法 常规方法 制备S.aureus悬液,分别感染人脐静脉内皮细胞和人羊膜细胞10、30、60、120 min.采用光学显微镜和荧光显微镜观察S.aureus感染和细胞骨架微丝、微管重排情况;采用DAPI荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析S.aureus对HUVEC细胞诱导凋亡的影响.结果 S.aureus与HUVEC和WISH细胞共育10 min,即有细菌侵入,60 min后,HUVEC和WISH细胞的感染率分别达(54.9±2.4)%和(56.1±2.4)%;入侵HUVEC细胞和WISH细胞10、30、60、120 min时,触发微丝肌动蛋白(F-actin)重排百分率分别为(54.7±2.8)%、(63.0±2.9)%、(71.0±2.6)%、(39.5±2.7)%和(63.3±2.6)%、(65.0±2.9)%、(77.0±2.4)%、(44.0±1.8)%.10、30、60 min的F-actin重排百分率明显高于120 min(P＜0.05),此时微管变化不大;S.aureus感染HUVEC细胞60 min时,DAPI荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳均可出现细胞凋亡现象.结论 S.aureus在入侵HUVEC和WISH细胞时,可能通过F-actin细胞骨架重排来完成侵袭过程,且细菌侵入60 min后可诱导HUVEC细胞出现凋亡.     

外源性甘氨酸对金黄色葡萄球菌耐药及femA表达水平的影响

目的探讨外源性甘氨酸对金黄色葡萄球菌苯唑西林耐药水平及femA表达的影响。方法用琼脂平皿对倍稀释法检测不同浓度甘氨酸下苯唑西林对30株金黄色葡萄球菌的MIC值,用实时荧光定量PCR方法检测不同浓度甘氨酸下金黄色葡萄球菌femA表达水平。结果30株金黄色葡萄球茵中MSSA4株,低耐MRSA2株,高耐MR-SA24株,在0．2M外源性甘氨酸存在时MIC下降4-256倍,在0．3M外源性甘氨酸存在时MIC均〈0．25μg／ml。在所有金黄色葡萄球菌中均检测到femA表达,在0．2M甘氨酸存在时femA表达下降50％-80％,0．3M甘氨酸存在时femA表达下降75％-90％。结论外源性甘氨酸能降低金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药水平及femA表达水平。     

金黄色葡萄球菌对成年大鼠牙槽骨成骨细胞的侵入

目的：探讨金黄色葡萄球菌能否对体外培养的成年大鼠牙槽骨成骨细胞进行侵入,并分析其侵入能力.方法：对金黄色葡萄球菌株ATCC 25923进行培养,观察生长曲线,以感染复数（MOI）50∶1感染大鼠牙槽骨成骨细胞,分析金葡菌在培养15、30、45、60 min后侵入的菌落数及侵入率.结果：金葡菌感染后15 min未有细菌侵入成骨细胞,在30、45、60 min 时出现侵入现象,到60 min 时侵入最多.结论：金黄色葡萄球菌可以侵入体外培养的大鼠牙槽骨成骨细胞,其侵入数量随时间延长而增多.     

肿瘤成纤维细胞通过外泌体miR-21促进膀胱癌细胞侵袭转移

目的:探讨外泌体miR-21参与肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)促进膀胱癌细胞侵袭转移的作用及机制.方法:利用组织块贴壁法分别从膀胱癌和癌旁组织分离CAF和正常成纤维细胞(normal fibroblast,NF),利用荧光实时定量PCR检测膀胱癌组织,CAF、NF...     

突变体c-myc对平滑肌细胞迁移和侵袭的调控

目的 研究突变体c-myc(T58A、S62A)、WT c-myc对平滑肌细胞迁移和侵袭的调控.方法 平滑肌细胞转染T58A、S62A、WT后采用Western blot检测法、荧光探针检测法、细胞迁移和侵袭检测法,测c-myc的表达、转录活性及平滑肌细胞迁移和侵袭的程度.结果 平滑肌细胞转染T58A、S62A、WT后...     

烧伤创面的细菌分离及其耐药性的初步分析

目的 适时了解烧伤病房的细菌分布及耐药情况,为临床有针对性地选择和合理使用抗生素提供依据.方法 分离7个月份的烧伤患者创面细菌,并对其主要的感染菌种进行耐药性分析.结果 从烧伤患者创面共分离到细菌204株,前三位依次为金黄色葡萄球菌(87株)、铜绿假单胞菌(44株)和奇异变形杆菌(43株).金黄色葡萄球菌对万古霉素(V...     

胸腺肽对胆囊癌细胞侵袭能力的抑制作用

目的研究胸腺肽（Ta1）对人胆囊癌细胞株（GBC-SD）侵袭能力的影响。方法培养GBC-SD,将其分为对照组、不同浓度的Ta1给药组（100、200、400μg/m1）。经细胞侵袭实验观察Ta1对GBC-SD细胞侵袭能力的影响;MMPs明胶酶谱分析检测细胞MMP-2、MMP-9的蛋白表达变化。结果与对照组比较,随着Ta1给药浓度的升高,各组癌细胞的侵袭能力呈浓度依赖性下降,各组间的差异有统计学意义（P〈0.05）。Ta1不同浓度组胆囊癌细胞MMP-9蛋白表达较对照组明显下降,且随着Ta1浓度的升高,MMP-9蛋白表达逐渐下降。而Ta1对MMP-2蛋白的表达无明显影响。结论 Ta1对GBC-SD侵袭能力具有抑制作用,且随Ta1浓度的升高,GBC-SD侵袭能力逐渐下降,其机制之一可能是降低了胆囊癌细胞MMP-9的蛋白质表达。