含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

负载hTERT调控相关miR-138慢病毒的包装及鉴定

目的:构建hTERT(人端粒酶逆转录酶)调控相关miR-138慢病毒表达载体.方法:化学合成miR-138前体序列,连接到包含U6启动子及GFP(绿色荧光蛋白)报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共转染至HEK 293T细胞包装病毒,并对病毒进行鉴定.结果:双酶切和测序结果证实miR-138前体核苷酸链序列捕入正确,包装的慢病毒滴度达7×107TU/ml;包装成功的慢病毒可有效增加感染细胞内miR-138的表达丰度,并可下调hTERT表达水平.结论:成功包装并鉴定人miR-138慢病毒表达载体.     

肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

目的探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响。方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒。针对已经筛选确定的IGF1R基因干扰有效序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R质粒。RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。用sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R, psPAX2, pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度。RT-PCR、Westernblot检测IGF1R表达,竞争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性。CCK-8法检测细胞生长。结果成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R;滴度为4.58×109PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R抑制了肝癌细胞IGF1R表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长。结论本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路。     

Construction of p100 Knock Down Stable HepG2 Cell Line with a p100 shRNA Expression Lentiviral System

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系.方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建p LKO.3G-p1001慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定.将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒.运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果.结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株.慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90％以上细胞发出绿色荧光,Western blot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系.     

p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建

目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统构建p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的OligoDNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Westernblot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Westernblot证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。     

针对人IKKα、IKKβ基因RNA干扰慢病毒质粒的构建及其对人肝癌细胞生长的影响

目的 构建人IKKα、IKKβ基因RNA干扰慢病毒质粒.并观察其对肝癌细胞生长的影响.方法 将目的 片段亚克隆入慢病毒载体中,包装成病毒后感染人肝癌细胞,检测细胞IKKα、IKKβ的表达,并将感染细胞接种于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果 目的 片段被成功克隆入载体质粒.pLenti-GFP-IKKα-SiRNA慢病毒液感染的细胞中IKKα蛋白表达明显降低,pLenti-GFP-IKKβ-SiRNA慢病毒液感染的细胞中IKKα蛋白表达明显降低.实验组裸鼠皮下肿瘤出现晚且生长缓慢.结论 成功构建了针对人IKKα、IKKβ基因RNA干扰慢病毒质粒,包装成病毒后感染人肝癌细胞后能抑制其生长.     

siRNA沉默CD147基因对肝癌细胞的影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默CD147基因在肝癌细胞HepG2中的表达,探讨CD147基因对肝癌细胞生长、凋亡的影响.方法 根据CD147 cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pSileneerTM4.1-CMV neo构建重组表达载体,鉴定后转染至HepG2细胞,Western blotting法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 成功构建了针对CD147基因表达的干扰质粒,有效抑制了HepG2细胞增殖,促进了HepG2细胞凋亡.结论 CD147靶向RNA干扰重组表达栽体为肝癌的基因治疗提供了可能.     

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响

目的构建LV5-h Cx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响。方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-h Cx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度。将慢病毒载体LV5-h Cx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFPh Cx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×10¹¹TU·L^-1的重组慢病毒LV5-GFP-h Cx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ。过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力。     

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7（pLL3.7）连接,产生pLL3.7HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定 用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞（磷酸钙转染法）,包装产生慢病毒,将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7HIF-1α 包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ml。结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。     

HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的 构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3'UTR RNA 与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础.方法 根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达.结果 经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体.通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光.嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达.结论 成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株.     

子宫中隔切除术后预防粘连方法探讨

目的 探讨子宫中隔并不孕患者宫腔镜术后不同处理方法预防宫腔粘连的效果.方法 55例子宫中隔并不孕患者行腹腔镜监护下宫腔镜子宫中隔切除术(TCRS),术后针对不同患者采用不同术后处理措施,包括宫腔放置与不放IUD,是否进行人工周期治疗,部分患者术后使用GnRH-a类药物治疗术后第1、3个月行宫腔镜检查随访,宫内放置IUD的患者;于术后第3个月取环.结果 54例患者术后进行宫腔镜检查随访,其中40例分别于术后第1、3个月完成了术后2次宫腔镜检查,另14例只完成一次检查.宫腔术后放环与否对术后宫腔形态影响无差异(P>0.05),术后使用人工周期治疗患者较未使用者子宫内膜厚,此两者术后第3个月宫腔镜检查发现宫底创面均已有内膜覆盖.使用GnRH-a类药物患者术后官腔形态满意.结论 TCRS术后宫腔放置IUD无助于预防术后粘连的发生;术后人工周期治疗应更个体化并有针对性的使用GnRH-a类药物治疗.术后及时进行宫腔镜检查随访可防止术后宫底新粘连的形成.     

欧洲药典适用性认证介绍

目的介绍欧洲药典适用性认证程序,为国内药品监管机构和原料药生产企业提供信息,促进我国原料药生产企业的国际化。方法通过查阅调研欧盟相关药品法规和与EDQM同行面对面的交流,详细了解欧洲药典适用性认证的组织机构和具体程序。结果与结论欧洲药典适用性认证程序在对原料药的质量控制有重要作用,加强了药典的监管力度,进一步保证了原料药的质量、安全性和有效性。     

10例狂犬病误诊原因分析

狂犬病近年来发病率有逐年增加的趋势,近十二年来,我们共遇见狂大病２３例,其中１０例被误诊为其它疾病,现就其误诊原因进行分析如下。１临床资料１．１ 一般资料：男８例,女２例;年龄最大７８岁,最小４岁。发病季节为３月～１１月。首诊科室,儿科３例、内科３例、转院３例、急诊科１例。１．２ 临床表现：发热７例,恐风５例,恐水６例,怕光３例,流涎１０例,胸闷、气促、呼吸困难４例,烦躁不安１０例,多汗７例,恐惧６例,肢体麻木４例,抽搐４例,恶心、呕吐２例,昏厥１例。所有病例发病至死亡时间为２天～６天,死亡原因为…     

新疆维吾尔自治区基层医院平均住院日调查分析

目的 通过对新疆维吾尔自治区14个县乡级医疗机构住院患者平均住院日及影响因素进行分析,为县乡级医疗机构进一步提高医疗管理质量提供依据.方法 将2009-2010年1504例县乡级医院住院患者平均住院天数,按性别、年龄、院别、付费方式、疾病分类进行描述性统计和秩和检验分析.结果 不同性别间及院别间平均住院日差异均有统计学意义(均P＜0.05),男性平均住院日为10.39 d,女性为8.69d,乡级医院为9.27d,县级医院为9.50 d.不同年龄间平均住院日差异有统计学意义(P＜0.05),小于15岁组、15 ～24岁组、25～44岁组、45 ～65岁组、大干65岁组平均住院日分别为8.10 d、7.66d、8.83 d、10.26 d和11.33 d.自费患者平均住院日为8.39 d,新农合组为9.10 d,商业保险组10.17 d,社会基本医疗保险患者则为11.08 d.不同疾病分类间平均住院日差异明显,妊娠类平均住院日最短,为6.73 d,而肿瘤患者则为14.26 d.结论 不同性别、不同年龄段、不同疾病分类及不同付费方式间平均住院日存在差异,县级医疗机构和乡级医疗机构住院患者平均住院日也存在差异.     

住院患者精神用药情况调查分析

目的：了解目前住院精神患者的药物使用情况。方法：采用一日法调查西安市精神卫生中心403例住院精神患者诊断和治疗情况，并与上海市精神卫生中心2004年调查结果相比较。结果：①传统精神药物使用显著减少，新型精神药物使用占据首位；②抗精神病药物使用趋向小剂量化；③本组联用丙戊酸盐类药物显著增多；④我院精神药物使用情况与上海精神卫生中心比较有显著差异。结论：近年来精神药物使用情况已发生了显著变化，与新型精神药物疗效好，副作用少，患者依从性高有关。