RNAi抑制胰腺癌PANC-1细胞MMP-2mRNA的表达

目的 观察RNAi体外沉默基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因对胰腺癌PANC-1细胞MMP-2 mRNA表达的抑制作用.方法 设计靶向MMP-2的siRNA,并构建到pGCsi-U6质粒,重组质粒脂质体法转染PANC-1细胞;流式细胞术检测细胞GFP表达率,RQ-PCR检测细胞MMP-2的mRNA表达水平.结果 PCR鉴定证实重组质粒构建成功,质粒转染细胞GFP表达率最高达82.1%.转染干扰质粒的PANC-1细胞MMP-2基因mRNA表达抑制了71.74%(P＜0.05).结论 RNAi明显抑制胰腺癌PANC-1细胞MMP-2 mRNA的表达,可望RNAi能为胰腺癌治疗开辟新的思路.     

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的：探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法：构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA（shRNA）的质粒载体Pgenesil—UNC581及Pgenesil—UNC582作为实验组，并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil—NC作为阴性对照，将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染24h后，荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率，用G418筛选得到稳定转染的细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果：转染24h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，转染效率约为40％～50％。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制。两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88％和52％。结论：本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达，为进一步实验奠定了基础。     

RNA干扰ezrin基因真核生物表达载体的构建及鉴定

目的 构建用于RNA干扰(RNAi)的小发夹RNAshRNA表达载体并检测其对ezrin基因的沉默效果.方法 以ezrin为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,设计和构建重组体,根据GeneBank数据库提供的ezrin核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,设计2条小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链,克隆到空载体pGenesil-1中,转化DH5a菌株,提取质粒,予以酶切和测序鉴定;重组质粒转染786-0肾癌细胞株,运用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明成功地构建重组质粒shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2;荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,肾癌细胞中shRNA-ezrinl、shRNA-ezrin2 mRNA相对表达量分别为(0.3376±0.0166)及(0.4661±0.0266),shRNA-ezrinl与shRNA-ezrin2相对表达量差异有统计学意义(P＜0.01),根据基相对表达量算出shRNA-ezrinl,shRNA-ezrin2 ezrin-mRNA的表达量抑制率分别为66.33％及53.29％.转染重组质粒后显著抑制786-0细胞中ezrin mRNA和蛋白表达,其中shRNA-ezrinl的抑制效率最高.结论 成功构建ezrin基因的shRNA表达载体,并筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-ezrinl,为进一步研究ezrin基因沉默对肾癌786-0细胞株生物学行为的影响奠定基础.     

构建干扰RhoA的短发夹RNA真核表达载体

目的利用pGenesil-1质粒构建针对RhoA的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法设计2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,胶回收酶切pGenesil-1大片段,T4DNALigase连接酶切大片段和DNA序列,得到质粒pGenesil-1-RhoA1和pGenesil-1-RhoA2.转化感受态细胞DH5a,扩增,提取重组质粒进行酶切鉴定。结果成功构建靶向RhoA的shRNA重组质粒载体.酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。结论表达靶向RhoA的shRNA表达框成功构建在重组质粒载体上。     

pRNAT-U6.1/Neo系统在E2F-3基因RNA干扰载体构建中的应用

目的:构建针对E2F-3基因的siRNA表达载体.方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F-3基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火、克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,重组构建RNAi质粒.通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果.结果:重组构建的pRNAT-U6.1/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致,插入序列无点突变位点.结论:载体的成功构建为进一步研究E2F-3基因在膀胱肿瘤中的作用奠定了基础,为进一步以其为靶点进行膀胱癌细胞系体外实验创造了条件.     

胰腺癌Bx-PC3细胞Survivin基因ShRNA质粒表达载体的构建

目的：构建针对胰腺癌Bx—PC3细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体。方法：以Survivin基因为靶点，通过自行设计并构建包含两段短发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA），携带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1 Survivin shRNA载体，利用脂质体介导的方法转染人胰腺癌Bx—PC3细胞，RT—PCR观察其对Bx—PC3细胞Survivin基因表达的影响。结果：HE1质粒和HE2质粒的酶切鉴定正确，质粒转化菌液HE1、HE2进行测序分析均为插入正确的克隆质粒。胰腺癌Bx—PC3细胞转染成功。转染细胞后SurvivinmRNA的表达有明显抑制。结论：实验构建针对胰腺癌细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体成功。     

MMP-2和TIMP-2在胃癌组织中的表达特点及临床意义

目的:探讨基质金属蛋白酶(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-2)在胃癌组织中的表达特点及临床意义.方法:选取完整的胃癌术后病例63例,采用S-P免疫组织化学方法,检测63例胃癌组织MMP-2、TIMP-2 的表达.结果:胃癌组织的MMP-2、TIMP-2的阳性表达率分别为52.4%(33/63)和54%(34/63).MMP-2的表达强度随着分化程度的升高而降低(P<0.05);TIMP-2 的表达强度随着的分化程度升高而升高(P<0.05),随着淋巴结转移的出现而下降(P<0.05).胃癌组织MMP-2、TIMP-2的表达呈明显负相关(P<0.05 ),MMP-2、TIMP-2 的表达与侵犯层次无相关性(P＞0.05).结论:MMP-2、TIMP-2是胃癌浸润转移的正/负调控因子,MMP-2、TIMP-2可做为判断胃癌恶性行为的重要生物学指标.     

人脑胶质瘤组织中的MMP-2和TIMP-2表达

目的:旨在研究基质金属蛋白酶-2和组织金属蛋白酶抑制剂-2在人脑胶质瘤组织中的表达及其与胶质瘤的侵袭发展、分级之间的关系。方法:采用RT-PCR方法对36例脑胶质瘤标本进行了MMP-2、TIMP-2表达情况的检测。结果:在高、低度恶性组中,MMP-2及TIMP-2的含量较正常对照组均有明显升高并有显著性差异(P<0.05),且高,低两组之间也有显著性差异(P<0.05).另外,MMP-2/TIMP-2的比值在各组之问也有显著性差异(P<0.05).结论:MMP-2及TIMP-2对胶质瘤恶性程度的评估有重要的意义。     

MMP-2、MMP-9及TIMP-1在颅内动脉瘤中的表达及意义

目的观察基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）在颅内动脉瘤中的表达情况,并且与正常颅内动脉的表达相比较,以探讨动脉瘤的发病原因及机制。方法用免疫组织化学方法对31例经手术切除的颅内动脉瘤标本和16例脑外伤病人切除的正常血管中的MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达进行检测和比较,将所得染色标本在光镜下观察,并用医学图像分析系统进行定量分析。结果动脉瘤标本中的MMP-2、MMP-9及TIMP-1明显高于正常血管。结论MMP-2、MMP-9及TIMP-1与颅内动脉瘤密切相关,可能在颅内动脉瘤形成、发展及其破裂过程中发挥重要作用。     

hMSH2反义核糖核酸表达质粒的构建

利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）, 特异地扩增HeLa细胞中hMSH2 cDNA的最保守区域, 并将其克隆到TA载体, 从重组质粒两端进行序列分析, 证实为目的片段. 将该目的片段反向克隆到哺乳动物表达载体pREP9的 BamHⅠ和KpnⅠ位点之间, 筛选后得pREP9-hMSH2反义表达重组质粒. 用磷酸钙-DNA共沉淀法将重组质粒DNA及载体DNA分别导入HeLa细胞, 经G418筛选, 扩大培养. 凝胶阻滞实验证实转染有pREP9-hMSH2重组质粒的HeLa-MSH2细胞抽提物中G·T和A·C错配结合蛋白质表达明显降低, 为研究hMSH2基因功能提供了一有效细胞系.     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。     

Construction and identification of lentiviral RNA interference vector of rat leptin receptor gene

Leptin resistance is a main mechanism of acquired childhood obesity, and the suppression of long form of leptin receptor (OBRb) gene expression in dietinduced obese rats indicates that the down-regulation of OBRb gene expression plays a pivotal role in the mechanism of leptin resistance. The aim of the present study was to construct the lentiviral RNA interference (RNAi) vector of rat OBRb gene and evaluate the effects of siRNA on silencing OBRb gene expression. The target sequence of siRNA-OBRb was designed, and the complementary DNA containing both sense and antisense oligonucleotides was synthesized. After phosphorylation and annealing, these double-stranded DNA was cloned to pRNA-lentivector-VGFP to construct pRNA-Lenti-OBRb-VGFP recombinants with U6-containing promoter, target sequence and Poly III terminator. Then, the products were con.rmed by electrophoresis and sequencing analysis, and the effects of RNAi on reducing gene expression were further con.rmed by real-time polymerase chain reaction in transfected rat glioma cells expressing OBRb. The target sequence of siRNA-OBRb was successfully cloned to pRNA-lentivector-VGFP, and the RNAi protocol speci.cally reduced the expression of OBRb mRNA by approximately 80% compared with controls in transfected rat glioma cells. The successful construction of rat lentivirus vectors expressing OBRb-specific shRNA may be useful for further investigation in vivo.     

稳定整合靶向细胞周期蛋白E1基因RNA干涉载体的肝癌细胞系的建立

目的探讨经载体介导的RNA干涉法建立周期蛋白E1表达稳定抑制细胞系的可行性。方法将源自pSSC-9质粒的neo基因亚克隆至干涉载体pSilencer 1.0-U6以构建稳定干涉载体pSineo,再将其与合成的靶向周期蛋白E1基因特定的RNA干涉模板片段连接,重组载体经脂质体LipofectamineTM2000介导法转染肝癌细胞株BEL-7402;转染细胞经G418筛选,常规抽提G418抗性克隆细胞的基因组DNA并行PCR法鉴定外源导入载体的稳定整合情况。结果酶切及测序鉴定结果均表明,重组载体pSineo-cyc E1符合预期设计;PCR鉴定结果显示,稳定筛选出的6个克隆均整合有靶向周期蛋白E1基因的干涉载体。结论本研究建立了6个稳定整合有靶向细胞周期蛋白E1基因RNA干涉载体的肝癌细胞系,为肿瘤的癌基因靶向干涉治疗作了有益探索。     

反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒

目的构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体。方法在正义和反义引物两端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体。脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响。结果成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右。结论采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法。     

携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.     

Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定

目的构建携带livin基因短片段发卡RNA（livin shRNA）的慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列（OligoDNA）,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL—GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论成功构建人livin shRNA慢病毒载体。     

ATX短发夹shRNA表达载体的构建和测序

目的 构建ATX基因重组表达载体,并进行测序鉴定,为下一步探索肿瘤基因治疗的途径打下基础.方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组表达载体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行序列鉴定.结果 成功构建了ATXshRNA重组表达载体.结论 ATX shRNA质粒表达载体的成功构建为研究ATX靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础.     

CDC25B3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.方法 合成CDC25B3基因RNAi有效靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与双酶切后的pGCL-GFP载体(含有U6启动子和GFP基因)连接产生LV-shCDC25B3慢病毒载体,挑选阳性克隆经PCR和测序鉴定.用脂质体转染法将LV-shCDC25B3、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功地构建了CDC25B3 shRNA的慢病毒载体LV-shCDC25B3.浓缩病毒悬液的滴度为1×108TU/ml.结论 成功构建人CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.     

RNA interference prevents lipopolysaccharide-induced preprotachykinin gene expression

We showed previously that lipopolysaccharide (LPS) induces noncholinergic airway hyperreactivity to capsaicin via an upregulation of tachykinin synthesis. This study was designed to test whether double-stranded preprotachykinin (ds PPT) RNA, RNA interference (RNAi), prevents the LPS-induced alterations. First, cultured primary nodose ganglial cells of newborn Brown-Norway rats were divided into four groups: control; LPS; LPS+RNAi; and LPS+RNAi+liposome. Second, young Brown-Norway rats for the in vivo study were divided into three groups (control; LPS; and LPS+RNAi), and ds PPT RNA was microinjected bilaterally into the nodose ganglia in the LPS+RNAi group. Then, ganglial cells were collected from the culture whereas the nodose ganglia and lungs were sampled from the animals, and PPT mRNA and substance P (SP) levels were analyzed. Also, airway reactivity to capsaicin was performed in vivo. LPS induced significant increases in PPT mRNA and SP levels in vitro and in vivo and an increase in airway reactivity to capsaicin in vivo. However, ds PPT RNA, but not scrambled RNA, prevented all LPS-induced alterations. The effect of ds PPT RNA was not enhanced by liposome in vitro. Therefore, we demonstrated that the local application of RNAi prevents effectively the activation of the noncholinergic system modulating the lungs/airways.