海马胆碱能刺激肽促进神经干细胞向神经元分化

目的探讨海马胆碱能刺激肽(HCNP)在神经干细胞向神经元分化过程中所起的作用。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14天后取切割穹窿海马伞侧海马制成海马提取液;将神经干细胞接种于24孔板中,分为HCNP与海马提取液联合培养组、HCNP组以及空白对照组,每组八孔;细胞分化至14天时行Tuj-1、MAP-2免疫荧光检测;计数Tuj-1、MAP-2阳性神经元数及细胞周长,并观察胞体大小和突起长度。结果联合培养组Tuj-1、MAP-2阳性神经元最多,胞体大,突起长;HCNP组神经元数量较前组少,胞体较小,突起数量和长度均小于前组;对照组则仅有少量胞体小、突起短的神经元。HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组神经元成熟度优于其它两组。结论 HCNP对神经干细胞向神经元的分化具有明显促进作用。     

HCNP与海马提取液对神经干细胞向胆碱能神经元分化的协同作用

目的:探讨海马胆碱能神经元刺激肽(hippocampal cholinergic neurostimulating peptide,HCNP)与海马提取液对海马神经干细胞向神经元及胆碱能神经元分化的协同作用。方法:取孕17 d SD大鼠海马组织进行神经干细胞的培养、增殖、传代,并将其接种于2块24孔板中,培养基中均含B27、微量脑源性神经营养因子(BD-NF),将培养孔分为6组:H+T组,加入HCNP和切割穹窿海马伞侧海马提取液;H+N组,加入HCNP和正常侧海马提取液;H组,加入HCNP;T组,加入切割穹窿海马伞侧海马提取液;N组,加入正常侧海马提取液;对照组,不加HCNP和海马提取液。分化14 d后行MAP-2/ChAT免疫荧光双标检测。结果:与其它各组相比,H+T组分化的MAP-2阳性神经元最多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例最高(P<0.05);与N组相比,H+N组MAP-2阳性神经元较多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例也较高(P<0.05);与对照组相比,H组T组均可见一定数量的MAP-2阳性神经元及ChAT/MAP-2双标阳性神经元(P<0.05);N组以及对照组中MAP-2阳性神经元的数量和ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例则最低。结论:在微量BDNF存在的情况下,HCNP可促进海马神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化,切割侧海马提取液与HCNP可发挥协同作用。     

神经生长因子对中枢神经系统胆碱能神经元的影响

神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）是一种经典的神经营养因子。NGF在周围神经系统（PeriPheralnervoussystem，PNS）参与交感神经元、神经嵴起源的感觉神经元的发育、存活、维持及损伤修复等作用已逐渐为人们所认识[1-2]。八十年代后，人们发现NGF对中枢神经系统（centra     

新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究

本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化。利用含b FGF(20ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β微管蛋白(Tuj1 )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化。结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3. 9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9. 6%分化成为胆碱能神经元。提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化。     

Lhx8基因沉默抑制NGF诱导的海马NSCs向胆碱能神经元分化的研究

目的:明确Lhx8在神经生长因子(nerve growth factors,NGF)促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化中的作用。方法:体外培养海马神经干细胞并应用NGF促进其向胆碱能神经元分化的过程中,将构建的Lhx8干扰慢病毒加入至培养液中,7 d后应用免疫荧光标记技术检测分化所得胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)双标阳性细胞。结果:在空白对照组中,仅检测到少量的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在NGF组或是NGF联合阴性对照慢病毒组中则可检测到较多的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在加入Lhx8干扰慢病毒的实验组中,分化所得的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞数较NGF组或是NGF联合阴性慢病毒组明显减少。结论:Lhx8基因沉默抑制了NGF诱导的海马神经干细胞向胆碱能神经元的分化。     

神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经细胞

本文观察骨形态发生蛋白4(BMP4)在体外对原代分离培养的大鼠脑神经干细胞(NSCs)的胆碱能诱导分化效应.将从两月龄大鼠脑海马、纹状体等区域分离的细胞, 培养于含EGF和bFGF的DMEM/F12培养液中, 在光镜下观察细胞的形态特征, 并行nestin免疫细胞化学染色.24h后, 一半细胞改换成含有BMP4的培养液培养作为实验组, 另一半细胞继续用原培养液培养作为对照组.在培养第8天, 采用间接免疫荧光染色, 观察培养细胞的胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗原的表达.结果表明实验组呈ChAT阳性的细胞较多, 发出较强的绿色荧光, 具有神经元的形态特征;对照组呈ChAT阳性的细胞较少, 发出的荧光较弱.另外行FITC标记的流式细胞术, 检测NSCs的分化、结果表明实验组有16%的细胞呈ChAT阳性,而对照组只有约7%.由此认为BMP4具有诱导NSCs分化成具有胆碱能特性的细胞的功能.     

神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化研究进展

在帕金森病的细胞移植治疗研究中 ,如何在体外获得足够的多巴胺能神经元一直是一个难以解决的问题。干细胞的研究让人们看到了希望的曙光 ,利用干细胞不仅能在体外大量得到相关的神经元 ,而且也可能解决胎脑移植引发的伦理问题。本文就神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化及相关因素的研究进展作一综述。     

神经干细胞向神经元诱导和分化的研究

为探讨无血清条件下联合应用bFGF、PDGF、RA、HRG、Forskolin对大鼠神经干细胞诱导分化的作用,本研究采用体外分离、培养神经干细胞,传2~3代后,联合应用因子体外诱导神经干细胞分化等方法;通过Ⅱ型微管相关蛋白(MAP2)和S100抗体免疫荧光染色鉴定分化的细胞;图像分析系统测量神经元样细胞的参数;全细胞膜片钳技术记录分化后细胞的钠电流。结果显示:MAP2阳性神经元样细胞所占比例,联合因子组明显高于血清组(P<0.05);胞体面积及周长、突起的长度,联合因子组明显高于血清组和bFGF组(P<0.05)。另外,联合因子组中80%形态似神经元样的细胞能诱发电压依赖性的Na+通道电流。以上结果表明在体外无血清条件下联合应用bFGF、PDGF、RA、HRG、Forskolin对大鼠神经干细胞向神经元定向诱导分化是可行的,分化的神经元比例高,且细胞更具有神经电生理特性。     

骨髓基质细胞对共培养条件下的脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的诱导

目的：研究骨髓基质细胞对共培养条件下脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的情况。方法：从孕龄13 d的胚胎大鼠脊髓组织中分离神经干细胞,采用含EGF及bFGF的无血清限定性培养基培养,并通过与骨髓基质细胞进行共培养,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,用细胞免疫荧光染色鉴定分化结果。结果：从胚胎脊髓中分离得到大量的神经干细胞,通过限定性培养基培养可获得干细胞球,与骨髓基质细胞共培养可被诱导分化,用细胞免疫荧光染色鉴定,可见有胆碱能神经元生成。结论：胚胎大鼠脊髓源神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并保持稳定的性状,在与骨髓基质细胞共培养时,可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

体外诱导人脐静脉间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下分离的间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可能性,以期为脐静脉MSCs的神经移植提供理论依据。通过在无菌条件下收集正常足月剖宫产新生儿脐带并对脐静脉进行胶原酶消化,将获取的内皮及内皮下贴壁细胞进行培养。经传代培养及免疫细胞化学鉴定后,取第2代细胞用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导其向神经元方向分化,并以免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果表明脐静脉经胶原酶消化后的贴壁细胞主要表现为间充质样细胞和内皮细胞;传2代后,间充质样细胞可得到纯化和扩增。免疫细胞化学染色显示诱导前细胞不表达血管性血友病因子(vWF),诱导后MSCs表达巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE),而不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。以上结果提示,来源于脐静脉内皮及内皮下的MSCs在体外可以培养、扩增,并具备在诱导剂的作用下向神经元样细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。     

海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞向神经元分化的作用

在已证明切割海马伞海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移作用的基础上,进一步探讨其诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用。取切割SD大鼠海马伞后14d及正常海马组织的匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d和正常海马56kD差异蛋白的胶条及空白对照胶条共培养,在倒置显微镜下观察神经干细胞球中细胞的迁移和分化情况,于第21d分别应用MAP-2免疫荧光和AChE组织化学方法检测人神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况,并进行神经元的计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计学分析。结果显示,分化的MAP-2阳性神经元的数量、细胞面积及细胞周长三项指标切割组最好,正常组次之,而空白对照组最差;三组AChE组织化学染色均为阴性结果。上述结果提示切割海马伞后海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞向MAP-2阳性神经元分化的作用,但不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化。     

体外诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的初步研究

目的 初步研究诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系向神经细胞定向分化可能性,为青光眼等视网膜视神经疾病的治疗提供可能的途径。方法 以Buffalo大鼠肝细胞培养上清进行胚胎干细胞ES－D3细胞系培养,参照Bain等方法进行改良,以视黄酸对ES－D3细胞进行分化诱导,1d后加入阿糖胞苷,相差显微镜下观察细胞生长情况。结果 加入视黄酸后1d,相差显微镜下可见散在1个、2个或多个突起的神经样细胞。加入视黄酸后2d、阿糖胞苷后第1d,可见大量1条、2条或多条突起的神经样细胞,并相连成网络结构。结论 视黄酸辅以阿糖胞苷在体外可成功诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系成为神经样细胞,并形成网络,结合我们裸鼠眼内接种ES－D3细胞分化为神经细胞样细胞研究结果,胚胎干细胞定向分化及移植,可望成为青光眼等视网膜视神经疾病治疗的一个新的途径。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞(ESCSCs)的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况,本文从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清限定性培养基培养,并通过添加维甲酸(RA)、音猬因子(SHH)和神经营养因子-3(NT-3)等诱导因子,进行干细胞体外诱导,用免疫荧光细胞化学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明:从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,通过含EGF和bFGF的限定性培养基培养可获得干细胞球,通过添加RA、SHH和NT-3等诱导因子后,可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示,胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ESCSCs性状,在添加特殊因子的条件下,并在体外ESCSCs可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。     

脊髓神经干细胞对小鼠视网膜移植的研究

目的　研究原代培养的脊髓神经干细胞在小鼠视网膜的整合和分化情况。　方法　利用细胞培养和体内移植技术 ,将原代脊髓神经干细胞 (NSC)移植到不同年龄小鼠的视网膜 ,并对移植后细胞的整合及分化情况进行了免疫组织化学分析。　结果　 1 移植的NSC对组织的整合能力随宿主年龄的增加而降低 ;2 移植的NSC在宿主视网膜内可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。　结论　脊髓原代NSC移植到小鼠视网膜后的整合和分化均受内外因素的调控 ,为NSC的体内分化研究提供了新的证据     

神经生长因子诱导神经干细胞定向迁移

目的 探讨体外培养环境中神经生长因子(NGF)诱导神经干细胞定向迁移的特性。方法 运用半固体培养法结合单细胞克隆技术动态观察神经干细胞迁移情况,采用免疫细胞化学技术鉴定迁移细胞的类别。结果 在具有NGF浓度梯度的培养体系中,克隆细胞迁向高浓度NGF区域。在NGF源附近,这种定向迁移更加明显。迁移细胞随时间的延长表达神经元特异性抗原。在含均匀浓度NGF的培养基中细胞从球团向四周短距离的扩散,无方向性。所有迁出细胞随时间的延长进一步分化成熟,干细胞比率下降。结论 NGF有诱导神经干细胞定向迁移的作用。     

不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞比率的研究

目的 比较不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的比例.方法 取胎龄8～12 周的人胚胎脑海马,机械分离成单细胞悬液,以2×106 个细胞/ml接种到含h-EGF、h-bFGF和h-LIF的DMEM/F12培养液中.用1?S诱导神经干细胞球分化,12 h后行RNA-结合蛋白(musashil)免疫细胞化学鉴定,分别在2、5、7、14和23 d时行β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin/Tuj1)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(galc)免疫细胞化学鉴定.结果 诱导分化12 h时细胞球中绝大部分细胞为Musashil阳性细胞,第2 d时有少量的β-ⅢTubulin和GFAP阳性细胞,未见galc阳性细胞;第7 d时β-Ⅲ Tubulin阳性细胞数目最多,约为细胞总数的48.2%,以后逐渐下降,而GFAP阳性细胞数目在第2～23 d内呈逐渐增加趋势,到第23 d时达细胞总数的65.3%;随分化时间延长,只能检测到极少量的galc阳性细胞.结论 1?S可促使人神经干细胞分化为中枢神经系统的3种主要细胞类型,且其分化为神经元和胶质细胞的比例在不同时间点上有显著差异.     

胎儿骨髓间质干细胞体外诱导为神经细胞的初步实验研究

目的：体外定向诱导胎儿骨髓问质干细胞(MSC)分化为神经细胞。方法：采用Ficoll淋巴细胞分离液分离MSC，体外扩增、传代，采用β-巯基乙醇等诱导剂诱导MSC分化为神经细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NF200)、神经元烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，并且用RT-PCR鉴定NF200、NSE和GFAP的mRNA表达情况。结果：胎儿骨髓MSC在体外扩增第5代以后，经诱导后，形态学上可呈现神经细胞形态特征；免疫组化显示诱导出的神经细胞NF200、NSE和GFAP均有阳性表达；RT-PCR也显示诱导后表达量明显增加。结论：胎儿骨髓MSC在体外可以分化为神经细胞。     

嗅鞘细胞对神经干细胞增殖与分化的影响

观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响。取孕14d的SD胚鼠嗅球和腹侧中脑组织,分为OECs+NSCs共培养组和NSCs单独培养组进行培养。用p75免疫组化法,p75、BrdU/nestin、GFAP、NF(神经原纤维)和p75/nestin免疫荧光法分别鉴定OECs和NSCs并观察其增殖与分化。在培养7d时,绝大多数OECs呈梭形且发出2~3个突起,少量呈扁平椭圆形,两者均呈p75阳性。在7d时,单独培养的NSCs表现为典型的神经球悬浮生长,呈BrdU/nestin阳性;14d后偶见神经球贴壁分化,球中的少数细胞呈绿色荧光标记的NF阳性,大部分呈GFAP阳性。在5d时,OECs+NSCs共培养组形成神经球;10d时球体积不断增大,球心透亮度良好;12d后神经球的体积不再增大,开始贴附在OECs上生长,可见神经球向四周伸出突起并开始分化;14d时NSCs紧贴OECs生长并同OECs广泛交织在一起,可见NSCs和OECs分别呈nestin和p75阳性,NSCs中的大部分呈NF阳性,小部分为GFAP阳性。NSCs单独培养组和OECs+NSCs共培养组中NF阳性细胞率分别为47.2%和69.5%,前者明显少于后者(P<0.05)。以上研究结果提示OECs有促进NSCs增殖和诱导其分化的作用。