ku80蛋白表达水平与肝癌细胞侵袭迁移能力的相关性

目的观察ku80蛋白表达水平与肝癌细胞侵袭迁移能力的相关性。方法使用肝癌细胞系MHCC97-H、 MHCC97-L、HepG2及正常人肝细胞HL-7702为研究对象,分别采用RT-PCR、Western印迹方法检测ku80 mRNA及蛋白水平;体外划痕实验、Transwell侵袭实验观察4株细胞迁移、侵袭能力;免疫荧光检测ku80亚细胞定位;线性相关分析ku80及其mRNA与肝癌细胞系迁移、侵袭能力的相关性。结果 ku80 mRNA及蛋白在4株细胞系中均有表达,且在3株肝癌细胞中的表达明显高于正常肝细胞系HL-7702(均P0.05),其中MHCC97-H细胞表达水平最高(P0.01);体外划痕实验、Transwell侵袭实验显示3株肝癌细胞系的迁移、侵袭能力明显高于HL-7702细胞系(均PO.05),其中MHCC97-H的迁移侵袭能力最强(P0.01)。ku80蛋白定位于细胞核。线性相关性分析显示ku80蛋白及mRNA的表达水平与肝癌细胞系的迁移、侵袭能力呈正相关。结论 ku80蛋白主要在细胞核表达,其表达水平与肝癌细胞系的迁移、侵袭能力呈正相关。     

沉默诱骗受体3的表达对肝癌细胞生物学特性的影响

目的了解诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)在肝癌细胞中的表达水平,探讨其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响并探讨其分子机制.方法采用real-time PCR、Western blot以及ELISA等方法检测肝癌细胞Hep G2和Huh-7与正常肝细胞HL-7702和Chang liver中DcR3 mRNA和蛋白的表达以及分泌水平.设计和构建DcR3小干扰RNA重组慢病毒(LV-shDcR3),感染Hep G2和Huh-7细胞,同时以空病毒载体作为对照,Western blot验证沉默效果.感染后通过CCK-8和平板克隆形成实验观察细胞增殖情况;通过流式细胞术观察细胞凋亡情况;通过Western blot检测凋亡相关蛋白如剪切型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的表达情况.通过Western blot方法检测转染前后Fas L、LIGHT和TRAIL等死亡配体的表达情况.组间比较采用单因素方差分析.结果肝癌细胞Hep G2和Huh-7中DcR3的mRNA和蛋白表达水平与正常肝细胞相比明显升高,差异具有统计学意义.细胞上清中DcR3的分泌水平也明显升高.与空白组和感染对照组相比,感染LV-shDcR3组,肝癌细胞中DcR3的表达显著降低,细胞生存率明显降低,早期凋亡细胞比例明显升高,凋亡相关蛋白表达水平明显升高.与感染前相比,肝癌细胞感染LV-shDcR3后,TRAIL和Fas L的表达水平明显升高.结论 DcR3在肝癌细胞中高表达,下调肝癌细胞中DcR3的表达可以抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与TRAIL和Fas L凋亡通路有关.     

甘露糖受体在肝细胞癌中的表达及意义

目的:观察甘露糖受体(mannose receptor,M R)在肝细胞癌组织/肝癌细胞系中的表达,探讨其与肝细胞癌发生、发展及恶性程度的关系.方法:应用免疫组织化学检测50例肝细胞癌组织及癌旁组织、10例正常肝组织中MR的表达,免疫荧光法、Western blot法检测肝癌细胞系、肝细胞系中MR的表达.结果:免疫组织化学染色:肝细胞癌组织中M R的表达水平明显高于癌旁组织及正常肝组织(86%vs 76%,30%,P0.05).免疫荧光:MR在肝癌细胞系BEL-7402、Hep G2和人肝细胞系HL-7702中均有表达.在肝癌细胞系BEL-7402、Hep G2上有很强的MR表达,在肝细胞系HL-7702上MR的表达分布明显较少.Western blot法:MR在肝癌细胞系Hep G2、BEL-7402和人肝细胞系HL-7702上均有表达,肝癌细胞BEL-7402中MR的表达水平明显高于肝癌细胞Hep G2(P0.01)、肝细胞HL-7702(P0.01).结论:MR在肝细胞癌组织/肝癌细胞系中高表达提示可能与肝细胞癌的发生、发展及恶性程度密切相关.     

PBX3基因调控p38MAPK信号对肝癌细胞生长及5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的探讨前B细胞白血病同源盒基因(PBX)3基因对肝癌细胞活力、凋亡及5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702为对照细胞,Western印迹法检测肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H和SMMC7721细胞中PBX3的蛋白表达。以LipofectamineTM2000为载体,参照其转染说明将设计合成的PBX3的特异性siRNA(si-PBX3组)及阴性对照siRNA(NC组)转染SMMC7721细胞,仅加入脂质体的为空白对照组,Western印迹检测转染后的细胞PBX3的蛋白表达。SMMC7721细胞分为NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组,细胞处理48 h,噻唑蓝(MTT)及流式细胞术分别检测4组细胞活力和凋亡率。Western印迹检测细胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和p-p38MAPK的蛋白表达。结果 PBX3在肝癌细胞中的蛋白表达均显著高于在HL-7702细胞(P0.05)。与空白对照组相比,si-PBX3组细胞中PBX3蛋白表达显著降低(P0.05)。与NC组相比,si-PBX3组和5-FU组细胞活力及p-p38MAPK、PCNA蛋白表达水平均显著降低,而细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平均显著升高(P0.05);si-PBX3+5-FU组细胞活力及PCNA和p-p38MAPK蛋白表达均显著低于si-PBX3组和5-FU组,细胞凋亡率及Bax的蛋白表达均显著高于si-PBX3组和5-FU组(P0.05)。结论抑制PBX3基因表达可降低肝癌细胞活力,诱导细胞凋亡,增强肝癌5-FU化疗敏感性,机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。     

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase3,9活性与mRNA表达水平变化

目的 观察甘氨脱氧胆酸盐(glycodeoxycholate,GCDC)诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase3,9活性与Mrna表达的变化,探讨GCDC诱导肝细胞凋亡的机制.方法 体外培养HL-7702细胞,不同浓度的GCDC为处理因素,用Annexin V-FITC/PI双染色法结合流式细胞技术仪检测细胞凋亡率,比色法测定caspase3,9活性,RT-PCR检测caspase3,9mRNA表达水平.结果 100μM-250μM的GCDC处理HL-7702细胞24h后,其细胞凋亡率、caspase3,9活性与Mrna表达水平明显升高,并与GCDC呈浓度依赖性.结论 caspase3,9参与GCDC诱导HL-7702细胞凋亡调控,GCDC通过活化caspase9,进一步活化caspase3诱导肝细胞凋亡.     

DEK基因在肝癌中的表达及靶向抑制其表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨DEK基因在肝癌中的表达及RNA干扰抑制其表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702作为对照,RT-PCR检测人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475细胞中DEK mRNA表达;DEK-siRNA转染HepG2细胞,同时转染阴性对照和空白对照,转染48 h后Western blotting检测各组细胞中DEK、Cleaved caspase 3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况。结果各个肝癌细胞中DEK mRNA表达均显著高于正常细胞,差异有统计学意义(P0.01);DEK基因在HepG2细胞中表达最高,选择作为后续研究对象;转染DEK-siRNA后DEK蛋白表达显著降低;DEK-siRNA组细胞存活率及β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于空白对照组和阴性对照组,细胞凋亡率和Cleaved caspase 3蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P0.01)。结论抑制肝癌HepG2细胞中DEK基因可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。     

人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建人STIM1基因真核表达载体, 并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法: 提取HL-7702细胞总RNA, RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体, 酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序, 最后用重组质粒转染HL-7702细胞, 通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果: PCR扩增的片段长度为342 bp, 测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中. PCR-电泳和Westernb l o t实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论: 成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1, 并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达, 为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.     

多药耐药相关蛋白-3表达与肝癌耐药的相关性

目的 探讨多药耐药相关蛋白-3(MRP-3)的表达与肝癌耐药的相关性.方法 应用RT-PCR方法检测正常肝细胞L-02、肝癌细胞BEL及肝癌耐药细胞HepG2/ADM中MRP-3 mRNA的差异表达,再将MRP-3反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染进肝癌耐药细胞HepG2/ADM中,用MTT法、流式细胞仪及RT-PCR检测转染后细胞内阿霉素(ADM)的荧光强度、耐药指数及MRP-3 mRNA的表达情况.结果 肝癌耐药细胞HepG2/ADM中MRP-3 mRNA的表达明显高于正常肝细胞L-02和肝癌细胞BEL(P<0.05).MRP-3反义转染进耐药细胞后,可明显降低细胞内ADM的耐药指数,提高细胞内ADM浓度(P<0.05),细胞内MRP-3 mRNA的表达较未转染细胞下降了62.5%(P<0.05).结论 MRP-3的高表达可能是导致肝癌多药耐药的机制之一.     

诱骗受体3对肝细胞凋亡的影响

目的了解诱骗受体3(DcR3)对肝细胞凋亡的影响,探讨DcR3在此过程中的可能作用机制。方法体外培养人肝细胞细胞株,分别设置pEF1α-DcR3转染组、pEF1α-IRES转染组和阴性对照组。构建pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3真核表达载体,转染人肝细胞36 h,采用实时荧光定量PCR检测DcR3、Fas蛋白配体(Fas L)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子(TGF)β1的mRNA表达水平;Western Blot法检测DcR3蛋白表达变化;流式细胞术检测细胞凋亡情况。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t法。结果 pEF1α-DcR3转染人肝细胞36 h后,DcR3的mRNA表达量和蛋白表达水平与pEF1α-IRES转染组和阴性对照组相比,显著升高(F值分别为33 169.5、141.54,P值均0.01);pEF1α-DcR3转染组与其他两组对比,Fas L、α-SMA和TGFβ1的mRNA表达水平显著降低(F值分别为269 451.8、20 790.4、8067.8,P值均0.01),表明DcR3可以抑制Fas L、α-SMA和TGFβ1的表达;转染pEF1α-DcR3的肝细胞凋亡率较pEF1α-IRES组和阴性对照组显著降低(F=558.63,P值均0.01)。结论 DcR3能够抑制人肝细胞凋亡,下调Fas L、α-SMA和TGFβ1 mRNA的表达水平。     

QSG-7701和HepG2细胞支持不同乙型肝炎病毒复制模式及其机制

目的研究QSG-7701及HepG2细胞支持HBV复制模式的差异及其内在机制。方法质粒PUC18-HBV1.2转染QSG-7701与HepG2细胞后定量检测细胞上清液中HBV DNA和HBsAg;采用基因芯片技术比较分析二者基因表达差异并用实时定量PCR验证。结果HepG2细胞在转染后6 d内培养上清液可检出HBV DNA及HBsAg,QSG-7701细胞转染后2周内均可检出HBV DNA及HBsAg,且HBV DNA在10 d内保持相对稳定的高水平复制(1×107～3×107拷贝/ml);基因芯片检测结果示QSG-7701细胞中与HBV生活周期相关的因予如HLF、RXRα、IL-6高表达,而HBxIP、SPIK1为低表达,MMP3不表达。结论QSG-7701支持高水平的HBV复制,并可维持cccDNA池的相对稳定,基因差异表达可能为二者支持不同HBV复制模式提供解释。