CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

前列腺癌特异性启动子P（A）PTp的构建及评价

目的构建前列腺癌特异性启动子PSAe（AREc）-PSMAe-TARPp[P（A）PTp],并在腺病毒水平评价其启动目的基因表达的效率和特异性。方法巢式PCR扩增基因组DNA获得PSAe的AREc区基因、PSMAe基因和TARPp基因,并依次连接获得嵌合启动子P（A）PTp。采用Adeasy系统构建并制备P（A）PTp启动增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）表达的重组腺病毒Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP。不同感染复数（multi-plicity of infection,MOI）的Ad-pSh-CMV-EGFP感染各细胞系后48 h,流式细胞术确定最佳MOI;并以最佳MOI的Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP感染各细胞系,检测EGFP的表达效率。结果 PCR成功扩增并连接获得嵌合启动子基因P（A）PTp。采用Adeasy系统,构建并制备了重组腺病毒Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP。Ad-pSh-CMV-EGFP感染后,流式检测结果显示,前列腺癌细胞PC3和PC3M细胞的最佳MOI为100 MOI;而前列腺癌细胞DU145以及肝癌细胞SMMC-7721和HepG2为250 MOI。最佳MOI的Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP感染后,EGFP在各细胞系中的表达效率[P（A）PTvsCMV]为：PC3（25.56%vs77.76%）、DU145（50.50%vs65.26%）、PC3M（30.81%vs89.70%）、HepG2（6.26%vs63.76%）、7721（2.27%vs67.84%）。结论成功构建前列腺癌特异性嵌合启动子P（A）PTp,并证实能在前列腺癌细胞中特异并有效地启动EGFP的表达。     

泛素代谢系统相关基因FBG2在胃癌细胞系中功能意义的研究

目的初步探讨泛素代谢系统相关基因FBG2对于胃癌细胞生长、增殖、凋亡等生物学特性及成瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法将FBG2基因插入载体pcDNA3．1构建pc-FBG2真核表达载体。以脂质体介导转染MKN45胃癌细胞并以G418压力筛选法筛出稳定表达的克隆,对稳定表达株进行鉴定,然后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、细胞迁徙实验法等分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化,每种检测实验均设立pc-FBG2稳定转染细胞组、pcDNA3．1稳定转染细胞组和空白MKN45细胞组。结果与转染pcDNA3．1空载体及空白MKN45胃癌细胞相比,转染pc-FBG2载体的稳定表达细胞株生长有所加快,开始计数后第4、5、6、7天平均细胞计数显著增高（P〈0．05）,细胞周期检测显示pc-FBG2转染组G2／M期比例显著高于其他两组（P〈0．05）,而S期比例显著低于其他两组（P〈0．05）。细胞凋亡检测显示pc-FBG2转染组凋亡比例与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）,平板克隆形成实验结果显示pc-FBG2转染组平均克隆形成率显著高于其他两组（P〈0．05）,细胞迁徙实验结果显示pc-FBG2转染组穿膜率与其他两组相比无显著差异（P〉0．05）。结论FBG2基因在一定程度上可促进细胞生长及有丝分裂,对维持细胞恶性表型具有一定意义,但对细胞凋亡及浸润转移能力可能影响较小。     

pp32表达引起人肝癌细胞HepG2形态改变

目的:研究pp32在肝癌细胞中的作用.方法:采用RT-PCR的方法钓取pp32全长基因.脂质体介导的方法将pp32基因导入HepG2细胞.观察细胞形态,血清依赖性和接触抑制等细胞表型,测量细胞生长曲线,检测ALP、LDH、γ- GT、ALB和AFP等生化指标.结果:成功钓取了pp32全长基因,筛选获得pp32稳定表达的HepG2细胞株.pp32表达使HepG2细胞伸出细长突起,但不影响HepG2细胞增殖.ALP和LDH酶活力升高,其他指标没有变化.结论:pp32表达引起人肝癌细胞HepG2形态改变,但不改变其恶性表型.     

人源5-羟色胺转运体稳定表达细胞系的建立及其功能探究

目的建立人源5-羟色胺转运体（human serotonin transporter,hSERT）稳定表达细胞系,并对细胞系hSERT的结合活性和重摄取功能进行初步研究。方法采用脂质体转染法将hSERT转染于母细胞,即人胚胎肾（human embryo kidney,HEK）293细胞,应用抗生素G418（800μg/ml）压力筛选,并采用RT-PCR和Western印迹法在基因和蛋白水平对HEK293-hSERT细胞系进行鉴定和稳定性验证;采用放射性配体结合实验检测其与氚标西酞普兰（[3H]-citalopram）的结合活性,并检测其对[3H]5-HT的重摄取功能。结果 RT-PCR和Western印迹结果表明,所建立的HEK293-hSERT细胞系在15代内（P1,P5,P10,P15）均稳定表达hSERT;放射配体结合实验表明,HEK293-hSERT细胞系与[3H]-西酞普兰具有明显的特异性结合;并且在100 nmol/L[3H]5-HT条件下,具有明显的5-HT重摄取功能,这一作用可被10μmol/L的氟西汀所阻断,而母细胞HEK293无此功能。结论本研究所建立的HEK293-hSERT细胞系可稳定表达SERT,并且具有内源性SERT的结合和重摄取功能,是一种稳定表达功能性hSERT的细胞系。