缺氧诱导因子1α诱导人前列腺癌细胞上皮间质化改变的研究

目的:研究人前列腺癌细胞在缺氧诱导因子1α(HIF-1α)诱导下能否发生上皮细胞间质转化态(EMT)改变,进而致侵袭能力增强,并初步分析其分子机制。方法:应用RT-PCR技术检测LNCaP细胞及其亚细胞系C4、C4-2、C4-2B这4种EMT阴性的人前列腺癌细胞中波形蛋白(vimentin)mRNA表达情况,并凭此筛选出适合于进一步作转染诱导试验的细胞。用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1(-)/HIF-1α和pCD-NA3.1(-)空质粒后,分别转染上步试验所挑选出的人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/mLG418筛选抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α表达,Western印迹法检测EMT标志蛋白——上皮型钙粘素(E-cadherin)和vimentin的表达,Transwell验证转染后LNCaP细胞侵袭能力的改变。结果:RT-PCR证实4种EMT阴性的细胞中,仅LNCaP表达有vimentin编码基因,适合作转染诱导试验。免疫荧光也观察到HIF-1α转染细胞胞质中荧光亮度较空质粒转染细胞和未转染细胞明显增强。Western印迹法证实HIF-1α转染细胞发生了EMT转化,其E-cad-herin表达缺失,而vimentin表达增加。同时,Transwell体外侵袭试验也发现,LNCaP/HIF1α细胞的体外侵袭能力显著高于LNCaP细胞和LNCaP/pCDNA3.1(-)细胞。结论:HIF-1α过表达可以通过调节两种EMT相关蛋白诱导人前列腺癌细胞LNCaP发生EMT改变并致其侵袭能力增强。     

人工合成小分子RNA对前列腺癌细胞周期及增殖的影响

目的 研究人工合成的dsP21-555对前列腺癌细胞株PC-3和LNCaP细胞周期和增殖的影响。方法 合成dsP21-555（实验组）和dsControl（阴性对照组）,分别转染至PC-3和LNCaP。使用Real-time PCR及Western blotting分别检测分析前列腺癌细胞转染后的p21mRNA及p21蛋白的表达情况。流式细胞术检测细胞周期分布,使用MTT实验及集落形成实验检测细胞的活力及增殖能力。结果 转染dsP21-555后PC-3和LNCaP细胞中的p21 mRNA水平分别上调至2.90倍(P<0.01)和2.05倍(P<0.01)。Western blotting实验结果符合这一趋势。流式细胞术检测显示,转染dsP21-555后,在S期和G2/M期的细胞比例下降,在G0/G1期的细胞比例则增加。MTT实验显示,与dsControl组相比,转染dsP21-555后,PC-3和LNCaP细胞的活力明显降低。集落形成实验显示,dsP21-555组的集落的数量较少,细胞增殖能力降低。结论 人工合成的dsP21-555能明显激活前列腺癌细胞中p21基因的表达,并显著抑制前列腺癌细胞周期的进展和增殖。     

前列腺癌LNCaP细胞L-plastin启动子-1751C/T单核苷酸多态性导致与转录因子NKX3.1结合活性改变

目的 鉴定与前列腺癌LNCaP细胞肌动蛋白结合蛋白L-plastin启动子-1751C/T单核苷酸多态性位点结合的转录因子,并研究-1751C/T单核苷酸多态性导致与转录因子结合活性的改变.方法 应用荧光素酶活性实验和凝胶迁移实验分析是否有转录因子结合于L-plastin启动子的-1751C/T位点.应用生物信息学分析L-plastin启动子-1751位点可能的结合蛋白,并应用凝胶迁移超滞后实验证实.应用Western blot检测该蛋白在正常前列腺上皮及前列腺癌细胞中的表达水平.结果 有一个抑制性转录因子结合于L-plastin启动子的-1751T序列上.生物信息学预测L-plastin启动子-1751位点可能的结合蛋白有5个可能,凝胶迁移超滞后实验证实为NKX3.1.NKX3.1在前列腺癌细胞中过表达,与L-plastin启动子-1751T序列较-1751C序列有更高的亲和力结论 L-plastin启动子-1751C/T单核苷酸多态性导致与NKX3.1结合活性改变,可能与前列腺癌发病相关.     

缺氧诱导因子1α过表达对前列腺癌细胞血管生成能力的影响

目的:观察转染缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对人前列腺癌细胞血管形成相关蛋白的影响,并探讨其分子机制。方法:用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1(-)/HIF-1α后转染人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/ml G418筛选稳定表达的抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α过表达,Western印迹法检测血管形成相关蛋白血管内皮生长因子(VEGF)、iNOS、促血管生成素2(Ang-2)。结果:与未转染细胞LN-CaP相比,转染细胞LNCaP/HIF-1α中出现明显的HIF-1α蛋白条带,并激发出较强荧光,VEGF、iNOS表达增加,Ang-2未见明显变化。结论:HIF-1α过表达能够诱导LNCaP细胞血管形成相关蛋白表达增多,进而增强其体外血管形成能力。     

靶向TRPV6的siRNA对前列腺癌LNCaP细胞抑制作用的体外研究

目的:运用RNA干扰(RNAi)技术阻断前列腺癌LNCaP细胞中瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚家族6(TRPV6)基因的表达,探讨TRPV6基因沉默对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:针对TR-PV6基因,构建2条小干扰RNA(siRNA)序列;在脂质体介导下转染前列腺癌LNCaP细胞,用RT-PCR测定TRPV6mRNA的表达;MTT法和流式细胞技术测定siRNA对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果:两条siRNA序列均能有效地阻断LNCaP细胞中TRPV6基因在mRNA水平上的表达(P<0.01),且mRNA表达随着转染时间的延长而减少,转染72h后TRPV6mRNA的表达减少至对照组的27%和23%;siRNA转染能显著抑制LNCaP细胞增殖,转染48h细胞增殖抑制率最高,分别为34.53%和29.32%,与转染24h和72h比较有统计学意义(P<0.05);转染48h后,siRNA转染组G0～G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少,与空白对照组及阴性对照组相比有统计学差异(P<0.01);siRNA转染组细胞的凋亡率分别为14.45%和12.73%,显著高于空白对照组及阴性对照组3.78%和5.22%(P<0.05)。结论:针对TRPV6的siRNA在体外能有效地抑制LNCaP细胞TRPV6mRNA的转录,同时能够抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,使细胞周期出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率显著增加。     

缺氧诱导因子1α过表达对前列腺癌细胞血管生成能力的影响

目的：观察转染缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对人前列腺癌细胞血管形成相关蛋白的影响,并探讨其分子机制。方法：用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1（-）/HIF-1α后转染人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/ml G418筛选稳定表达的抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α过表达,Western印迹法检测血管形成相关蛋白血管内皮生长因子（VEGF）、iNOS、促血管生成素2（Ang-2）。结果：与未转染细胞LN-CaP相比,转染细胞LNCaP/HIF-1α中出现明显的HIF-1α蛋白条带,并激发出较强荧光,VEGF、iNOS表达增加,Ang-2未见明显变化。结论：HIF-1α过表达能够诱导LNCaP细胞血管形成相关蛋白表达增多,进而增强其体外血管形成能力。     

肿瘤抑制基因DBC2抑制乳腺癌MDA-MB-435S细胞增殖并诱导凋亡

目的 观察肿瘤抑癌基因DBC2(deletion in breast cancer 2)的过表达在乳腺癌MDA-MB-435S细胞中的功能.方法 野生型DBC2基因的真核表达载体pEBG-DBC2瞬时转染MDA-MB-435S细胞72 h,噻唑蓝(MTT)比色法绘制DBC2转染前后MDA-MB-435S细胞生长曲线;流式细胞术检测DBC2的瞬时过表达对MDA-MB-435S细胞周期的影响,TUNEL方法 原位检测DBC2的过表达诱导MDA-MB-435S细胞凋亡.结果 DBC2基因在MDA-MB-435S细胞中的过表达可显著抑制该细胞的增殖,同时DBC2基因的过表达可诱导该乳腺癌细胞周期的G_1期阻滞(64.05%比71.72%)和细胞凋亡(0.09%比5.29%).TUNEL实验证实DBC2诱导MDA-MB-435S细胞凋亡的百分比为8%.结论 DBC2基因体外抑制乳腺癌细胞生长的功能,可能通过细胞周期G_1期停滞,以及诱导细胞凋亡等机制实现.     

人类肿瘤细胞分化中细胞周期素的表达规律及作用机制

目的：探讨诱导人类肿瘤细胞分化过程中，细胞周期素（Cyclin）的变化在细胞周期调控机制中的作用。方法：应用全反式维甲酸（ATRA）处理HL－60细胞，流式细胞仪行细胞周期分析，应用十二烷基磺酰钠－聚丙烯胺凝胶电泳（SDS－PAGE）及Western Blot检测细胞周期素D1、E的蛋白表达量改变，使用流式细胞仪检测细胞周期素D1、E、A的表达量变化及细胞周期素B的时相性改变。结果：HL－60细胞ATRA诱导后，80％左右的细胞被祖滞在G0／G1期，S期细胞减少到2．81％，WesternBlot显示，诱导后，CyclinD1表达量明显降低，CyclinE表量高。流式细胞仪检测CyclinD1、CyclinE蛋白表达变化与WesternBlot结果相同，CyclinA表达量升高，CyclinB表达特征由经放导前的非时相性表达转为诱导分化后的时相性表达。结论：细胞周期素D1、E、A、B与肿瘤细胞分化的细胞周期调控有着密切的关系。     

shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.     

转录因子核因子-κB p65通过miR-17调控血管平滑肌细胞增殖的机制研究

目的研究miR-17在血管平滑肌细胞(VSCM)增殖中的作用,以及转录因子核因子(NF)-κB调控miR-17的作用机制。方法将miR-17mimics转染人VSCM,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期。生物信息学预测NF-κB p65与miR-17启动子区存在结合位点,将pcDNA3.1-p65与报告基因载体p GL3-miR-17启动子区共转染至293T细胞中,通过检测荧光素酶报告基因Luc活性分析NF-κB p65对miR-17启动子区的影响。脂多糖(LPS)刺激细胞后,检测NF-κB p65、miR-17的表达水平。结果与miR-NC组相比,转染miR-17 mimics后,VSMC增殖能力增强,差异具有统计学意义(P0.05),细胞周期G0/G1期明显减少,S与G2/M明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。与miR-17启动子区结合位点突变型(Mutant)组相比,转染miR-17启动子区野生型(Wild)组荧光素酶Luc活性增高,差异具有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,LPS刺激细胞后,NF-κB p65、miR-17表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 NF-κB通过直接结合miR-17启动子区,促进miR-17的表达从而促进VSMC的增殖。     

NKX3.1短发卡RNA表达载体对NKX3.1基因表达的抑制作用

目的 研究同源框基因NKX3．1短发卡RNA（shRNA）表达载体在前列腺癌LNCaP细胞中对目的基因的沉默作用，为研究NKX3．1基因功能建立平台。方法 构建针对NKX3．1的shRNA质粒载体（pU6／NKX3．1-1和pU6／NKX3．1-2），并观察其介导LNCaP细胞中NKX3．1表达沉默的效果以及NKX3．1表达沉默对LNCaP细胞生长的影响。结果 构建的质粒pu6／NKX3．1—1和pU6／NKX3．1-2能够有效地抑制NKX3．1的表达，使NKX3．1mRNA和蛋白表达量显著下降，其中pU6／NKX3．1-2的效应高于pU6／NKX3．1—1，分别达到83．7％和72．1％。NKX3．1表达沉默能够使LNCaP细胞生长加快，细胞形态无明显改变。结论 成功构建NKX3．1特异性shRNA真核表达载体，使LNCaP中的NKX3．1表达下调，初步证明NKX3．1在LNCaP细胞生长中起非常重要的作用，为进一步深入研究NKX3．1基因的功能提供实验基础。     

Expression profile of an androgen regulated prostate specific homeobox gene NKX3.1 in primary prostate cancer

PURPOSE: NKX3.1, a member of the family of homeobox genes, exhibits prostate tissue specific expression and appears to play a role in mouse prostate development. Rapid induction of NKX3.1 gene expression in response to androgens has also been described. On the basis of the established role of androgens in prostatic growth and differentiation and studies showing an association of aberrant homeobox gene expression with the neoplastic process, we hypothesize that alterations of NKX3.1 gene expression play a role in prostate tumorigenesis. MATERIALS AND METHODS: NKX3.1 expression was analyzed in matched, microdissected normal and tumor tissues from 52 primary prostate cancer specimens from radical prostatectomy by semiquantitative RT-PCR and in situ hybridization and correlated with the clinicopathologic features. NKX3.1 expression was quantified as differential expression between matched tumor and normal tissues and was grouped as overexpression in tumor tissue, reduced expression in tumor tissue and no change between tumor and normal tissues. Androgen regulation of NKX3.1 expression was also studied in LNCaP cells. Androgen receptor (AR) expression in prostate tumor and normal tissue was correlated with NKX3.1 expression. RESULTS: Comparison of NKX3.1 expression between normal and tumor tissues revealed overexpression in 31% tumor specimens (16 of 52), decreased expression in 21% tumor specimens (11 of 52) and no change in 48% specimens (25 of 52). When these expression patterns were stratified by organ confined and non-organ-confined tumor, a higher percentage of patients exhibited NKX3.1 overexpression in non-organ confined tumor (40%) versus organ confined tumor (22%). Elevated NKX3.1 expression significantly correlated with tumor volume and serum prostate specific antigen (PSA) level in the NKX3.1 overexpression group (p<0.05). Metastatic prostate cancer cell lines did not exhibit mutations in the protein coding sequence of NKX3.1. Additionally, the NKX3.1 expression correlated with AR expression (p<0.01) in vivo in human prostate tissues. Comparison of PSA and NKX3.1 expression in response to androgen revealed a rapid androgen mediated induction of NKX3.1 expression in LNCaP cells. In situ hybridization analysis of representative specimens confirmed RT-PCR observations. CONCLUSIONS: These results suggest an association of NKX3.1 with a more aggressive phenotype of carcinoma of the prostate. Correlation of AR expression with NKX3.1 in human prostate tissues underscores the androgen regulation of NKX3.1 in the physiologic context of human prostate tissues.     

同源框基因NKX3.1在前列腺癌组织中的表达及意义

目的　探讨同源框基因NKX3.1在前列腺癌中的表达意义。　方法　采用半定量RT PCR检测前列腺癌、良性前列腺、非前列腺组织标本NKX3.1mRNA表达状况并对其扩增产物进行测序。　结果　 76例前列腺组织中 ,NKX3.1表达 75例 ,表达率 98.7%。 96例非前列腺组织标本中 ,除 2例睾丸组织、1例乳腺组织有NKX3.1表达外 ,肾、膀胱、肝、回肠、脂肪、皮肤组织无 1例表达。前列腺癌组织NKX3.1表达量明显增高 ,良性前列腺增生组织表达量明显减弱 (P <0 .0 1) ;晚期前列腺癌组织NKX3.1表达明显高于早期前列腺癌 (P <0 .0 5 ) ;低分化前列腺癌表达高于中高分化前列腺癌 (P <0 .0 5 ) ;激素依赖性前列腺癌表达高于激素非依赖性前列腺癌 (P <0 .0 1)。NKX3.1表达高低与前列腺体积和血清总PSA浓度无关 (P >0 .0 5 )。　结论　NKX3.1基因具有前列腺组织特异性 ,其表达状况与前列腺癌分期、分级相关。NKX3.1表达对于判断前列腺癌病理生物学特性和前列腺癌治疗有重要意义。     

同源框基因NKX3.1 mRNA和蛋白在前列腺组织特异性表达及与前列腺癌关系的探讨

目的:分析同源框基因NKX3.1 mRNA和蛋白在国人前列腺组织表达状况以及与前列腺癌关系。方法:采用半定量RT-PCR、蛋白杂交和免疫组化检测76例前列腺组织、96例非前列腺组织标本NKX3.1 mRNA和蛋白表达状况。结果:RT-PCR检测显示76例前列腺组织NKX3.1 mRNA表达率98.7%,96例非前列腺组织标本中,除2例睾丸组织、1例乳腺组织有NKX 3.1表达外,其余肾脏、膀胱、肝脏、回肠、脂肪、皮肤组织无1例表达(P<0.01)。蛋白杂交显示NKX 3.1蛋白总阳性表达率前列腺组织为100%,睾丸、乳腺组织均为16.7%,膀胱、回肠组织为8.3%,其他肾脏、肝脏、脂肪和皮肤组织均为0(P<0.01)。免疫组化检测显示NKX3.1蛋白主要分布在前列腺上皮细胞,上皮细胞总阳性表达率为94.7%,间质细胞NKX3.1蛋白总阳性表达率为5.3%;NKX3.1蛋白强阳性表达率良性前列腺组织为13.6%,前列腺癌组为40.6%(P<0.01)。结论:NKX3.1基因不仅为前列腺器官特异性基因,并且可能是前列腺腺上皮细胞特异性基因,其表达与前列腺癌关系密切。     

Novel 20-epi-vitamin D3 analog combined with 9-cis-retinoic acid markedly inhibits colony growth of prostate cancer cells.

BACKGROUND: 1,25 dihydroxyvitamin D3 (1,25D) and retinoids may play an important role in preventing progression of prostate cancer. METHODS: We examined the ability of four novel 20-epi-vitamin D3 analogs (CB1093, KH1060, KH1266, and CB1267), either alone or in combination with 9-cis retinoic acid (RA) to inhibit colony growth of a human prostate cancer cell line, LNCaP, using soft agar as well as bone marrow stroma. Also, the effect of these analogs on the cell cycle and expression of Ki-67, p21(waf-1), and p27(kip1) in LNCaP cells was examined. RESULTS: The analog CB1267 was the most potent, with 8 x 10(-10) M of the analog inhibiting 50% colony growth (ED50) of LNCaP. 9-cis-RA also inhibited colony growth of LNCaP (ED50, 5 x 10(-7) M). Combined, CB1267 and 9-cis-RA synergistically inhibited colony growth and significantly increased the number of LNCaP cells in G0/G1 phase. Cell cycle arrest was associated with increased levels of p21(waf-1) and p27(kip1) and decreased expression of Ki-67 protein. Pulse-exposure to this combination (5 x 10(-8) M) irreversibly inhibited colony growth, both in soft agar and on normal human bone marrow stroma. CONCLUSIONS: Combination of a new vitamin D3 analog (CB1267) and a retinoid (9-cis-RA) potently inhibited colony formation of LNCaP prostate cancer cells in vitro, suggesting further studies in animal models. This combination may afford an interesting therapeutic approach to low-burden prostate cancer.