NGAL 基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定

目的对NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因5′侧翼区的转录调控启动子区进行分段定位鉴定.方法将NGAL基因5'侧翼区-416～ 84和-152～ 84两个区段分别克隆至专门用于研究启动子的报告基因表达载体pGL3-Enhancer(pGLE)中,构建表达载体pGLE -416和pGLE -152; 然后将pGLE -152和pGLE -416分别与pRL-TK载体共转染HeLa细胞、EC109细胞和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有启动子元件.结果与pGLE相比,pGLE -152在上述三种细胞中的相对荧光强度均明显增强(P<0.05),且在不同的细胞中增强的幅度明显不同.结论 NGAL基因的启动子位于-152～ 84区段内,启动子的强弱具有细胞特异性,这可能与增强子的协同作用相关联.     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的：对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白(neutrophil gelatlnase-associated lipocalin。NGAL)基因5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法：以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因5′侧翼区(-1431～ 84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果：在NGAL基因5′端-945～-658和-657～-4172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用，而在-416～-152区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论：在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着2个转录增强子元件和1个转录沉默子元件。     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和 1个转录沉默子元件     

NGAL基因5''''侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定

背景与目的:构建NGAL基因5'侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体.材料与方法:以PCR法从SHEEC食管癌细胞基因组DNA中扩增NGAL基因5'侧翼转录调控区不同长度片段G0-G6(-1431～ 84).PCR产物经pGEM-Teasy转载,再定向亚克隆插入pGL3-Basic.重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定.结果:成功构建NGAL基因5'侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pGLB-GO～G6.结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定NGAL基因5'侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件.     

食管癌细胞Ezrin基因转录调控区克隆及其启动子活性的鉴定

目的:克隆食管癌侵袭转移相关基因Ezrin的转录调控区序列,进行启动子活性鉴定及初步的生物信息学分析。方法:利用在线程序对Ezrin基因可能的转录调控区进行GC含量和CpG岛分析以及转录因子结合位点预测;采用PCR法从食管癌细胞基因组DNA中克隆Ezrin基因-1759/ 134和-726/ 134区段,构建萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGLB-hE(-1759/ 134)和pGLB-hE(-726/ 134),检测所克隆片段的启动子活性。结果:Ezrin基因5′侧翼区为高GC含量区,存在CpG岛,无典型的TATA盒,然而转录因子Sp1结合位点却无处不在。与对照质粒pGLB相比,重组质粒pGLB-hE(-726/ 134)具有较强的荧光素酶活性,pGLB-hE(-1759/ 134)的荧光素酶活性约是pGLB-hE(-726/ 134)的2倍。结论:Ezrin基因的-726/ 134区段具有启动子活性,含有Ezrin基因的核心启动子区和调节性启动子区;-1759/-726区段具有增强启动子活性的作用,含有Ezrin基因增强子元件区。     

PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析

背景与目的：PC－1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4－2中高表达的新基因。本文拟研究PC－1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法：以PC－1基因特异性DNA序列为探针与10对肿瘤和正常组织的总RNA进行杂交;以C4－2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增PC－1基因翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,将重组质粒瞬时转染C4－2细胞,荧光素酶定量分析检测启动子活性。结果：多肿瘤组织中PC－1基因的表达水平明显高于相应的正常组织中的表达;翻译起始位点上游340bp的片段没有启动子活性,而ATG前1099bp、1337bp,1579bp,1831bp和4939bp长度的片段都表现出启动子的功能活性。结论：PC－1基因在人前列腺癌以及多种肿瘤组织中被特异激活,表明该基因的功能可能和肿瘤的发生有关;研究的初步结果表明4939bp长度的启动子活性最强,以1831bp和4939bp之间可能含有转录增强子元件。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5’端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的：从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5’端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法：采用PCR法克隆NGAL基因5’端转录调控区，并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果：从SHEEC中获得了NGAL基因5’端转录调控区-1124— 65区段的克隆，该区段序列有3处点突变，在NGAL基因-1124— 65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点。结论：多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5’—UTR和3’—UTR的克隆与鉴定

背景与目的：NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）基因是lipocalin家族的一个新成员。以往我们曾研究发现NGAL基因在TPA诱导永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEC恶性转化的过程中显著过表达,但表达调控机制不清楚。本研究拟从SHEEC细胞中克隆NGAL基因的5’－UTR和3’－UTR（untranslated region）并进一步明确其结构特征。方法：采用RACE方法从SHEEC细胞中克隆NGAL基因的5’－UTR和3’－UTR;在测序基础上进行BLAST分析鉴定。结果：经合以往的实验结果,从SHEEC细胞中克隆了NGAL基因的69bp5‘-UTR和147bp3‘-UTR,而且序列分析未发现突变。结论：SHEEC细胞中的NGAL基因具备完整的5’－UTR和3’－UTR结构。     

MLAA-22基因上游调控区的分离及启动子活性分析

目的:分离MLAA-22 基因上游转录调控区序列,进行启动子活性鉴定。方法:人工合成MLAA-22 基因上游转录调控区序列MLAA-22（-999～+1)和MLAA-22（-1999～+1)两个区段,将两个区段插入到双荧光素酶报告基因表达载体psiCHECK-2的BglⅡ/NheI限制性内切酶位点中,构建双荧光素酶报告基因表达质粒,将重组质粒分别命名为psiCHECK-2-MLAA-22（-999～+1)和psiCHECK-2-MLAA-22（-1999～+1）;采用双荧光素酶报告基因系统检测所分离区段的启动子活性。结果:MLAA-22（-999～+1)和MLAA-22（-1999～+1）两个区段均具有较强的相对荧光素酶活性,并且MLAA-22（-999～+1)区段的相对荧光素酶活性明显高于MLAA-22（-1999～+1）区段。结论:MLAA-22 基因上游转录调控区（-999～+1）区段将是今后我们进行MLAA-22 基因上游转录调控区启动子活性研究的重点区域。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5''''-UTR和3''''-UTR的克隆与鉴定

背景与目的:NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)基因是lipocalin家族的一个新成员。以往我们曾研究发现NGAL基因在TPA诱导永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEC恶性转化的过程中显著过表达,但表达调控机制不清楚。本研究拟从SHEEC细胞中克隆NGAL基因的5'-UTR和3'-UTR(untranslatedregion)并进一步明确其结构特征。方法:采用RACE方法从SHEEC细胞中克隆NGAL基因的5'-UTR和3'-UTR;在测序基础上进行BLAST分析鉴定。结果:结合以往的实验结果,从SHEEC细胞中克隆了NGAL基因的69bp5'-UTR和147bp3'-UTR,而且序列分析未发现突变。结论:SHEEC细胞中的NGAL基因具备完整的5'-UTR和3'-UTR结构。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的 :从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因 5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法 :采用PCR法克隆NGAL基因 5′端转录调控区 ,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果 :从SHEEC中获得了NGAL基因 5′端转录调控区 - 112 4～ +6 5区段的克隆 ,该区段序列有 3处点突变 ,在NGAL基因- 112 4～ +6 5区段共鉴定出 78个有效顺式作用元件位点。结论 :多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素     

食管癌细胞NGAL 基因-416～+84 区段存在TPA 反应元件

 目的 本文旨在对NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件进行研究。方法 （1）采用PCR法从食管癌细胞中克隆NGAL基因5’侧翼区-416-＋84片段，然后分别插入质粒pGLB和pGLE，构建pGLB-416和pGLE-416荧光素酶报告基因表达栽体；（2）将pGLB-416和pGLE-416分别同pRL—TK共转染食管癌细胞EC109；（3）用TPA刺激转染的EC109，检测细胞相对荧光素酶活力，通过相对荧光素酶活力变化判定NGAL基因5’侧翼-416～＋84区是否存在TPA反应元件，同时进行生物信息学分析。结果 无论是pGLB-416还是pGLE-416，与pRL-TK共转染食管癌细胞EC109后，用TPA刺激，与其相应的空载体相比，转染细胞荧光素酶活力均极显著升高（t检验，P〈0．01），约分别升高46．82和46．41倍；而TPA刺激组与没有TPA刺激组相比，pGLB-416和pGLE-416转染EC109细胞荧光素酶活力分别显著升高了5．17倍和7．37倍（t检验，P〈0．01）。生物信息学分析显示，NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段至少存在4个潜在的TPA反应元件。结论 食管癌细胞NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段存在着TPA反应元件。     

HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定

 目的 鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。 方法 采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69, 相对于转录起始位点)和AP 1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性。 结果 在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP 1结合位点,ezrin基因基本启动子活性降低50％左右;同时置换Sp1结合位点和AP 1结合位点,启动子活性几乎完全丧失。ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合。 结论 HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP 1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录。     

人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定

[目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性。[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性。[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

食管癌细胞 SHEEC中NGAL基因 5′-UTR和 3′-UTR的克隆与鉴定

背景与目的 : NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因是 lipocalin家族的一个新成员 . 以往我们曾研究发现 NGAL基因在 TPA诱导永生化食管上皮细胞 SHEE向食管癌细胞 SHEEC恶性转化的过程中显著过表达 , 但表达调控机制不清楚 . 本研究拟从 SHEEC细胞中克隆 NGAL基因的 5′ -UTR和 3′ -UTR( untranslated region) 并进一步明确其结构特征 . 方法 : 采用 RACE方法从 SHEEC细胞中克隆 NGAL基因的 5′ -UTR和 3′ -UTR; 在测序基础上进行 BLAST分析鉴定 . 结果 : 结合以往的实验结果 , 从 SHEEC细胞中克隆了 NGAL基因的 69 bp 5′ -UTR和 147 bp 3′ -UTR, 而且序列分析未发现突变 . 结论 : SHEEC细胞中的 NGAL基因具备完整的 5′ -UTR和 3′ -UTR结构 .     

NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的：将不同长度的NGAL基因3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中，通过检测报告基因荧光素酶活力，确认NGAL3′端序列中是否含有增强子或抑制子元件。方法：应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1880bD)和F7(826bp)，将其克隆到pGEM-T easy载体，并测序验证；再亚克隆到pGL3-Pro-moter载体中，获得pGLP-F5和pGLP-F7表迭栽体；将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞，通过检测相对荧光素酶活力，确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件。结果：我们成功构建了pGLP-F5和pGLPF7重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比，酶活力未表现出明显的增强或减弱。结论：在本研究的实验条件下，NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用，或作用不明显。     

BCR基因5′启动子区多态性分析

背景与目的：bcr-abl融合基因被认为是慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)的分子标志,该融合基因的表达受bcr基因启动子的调控。本实验目的是研究bcr基因启动子区的多态性,并探讨其与CML之间可能存在的联系。方法：采用PCR方法扩增bcr基因5’启动子区1．13kb的序列范围,通过测序获得了30例CML和19例对照的启动子区序列。应用软件和在线工具对启动子序列进行转录因子结合位点分析和重复序列分析。结果：在所研究片段范围内共发现4处新的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和3处与参考序列不一致的碱基变异。其中2处SNPs和1处碱基插入位于转录因子结合位点中或邻近几个碱基内。各多态性基因频率在CML和对照人群中无统计学差异。结论：bcr基因的5’启动子区存在一定的序列多态性,主要为SNPs,未能证实其与CML之间存在相关性,但部分SNPs的定位使其有可能对基因的转录和表达产生影响。     

BCR基因5′启动子区多态性分析

背景与目的:bcr-abl融合基因被认为是慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)的分子标志,该融合基因的表达受 bcr基因启动子的调控.本实验目的是研究 bcr基因启动子区的多态性,并探讨其与 CML之间可能存在的联系.方法:采用 PCR方法扩增 bcr基因 5′启动子区 1.13 kb的序列范围,通过测序获得了 30例 CML和 19例对照的启动子区序列.应用软件和在线工具对启动子序列进行转录因子结合位点分析和重复序列分析.结果:在所研究片段范围内共发现 4处新的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和 3处与参考序列不一致的碱基变异.其中 2处 SNPs和 1处碱基插入位于转录因子结合位点中或邻近几个碱基内.各多态性基因频率在 CML和对照人群中无统计学差异.结论:bcr基因的 5′启动子区存在一定的序列多态性,主要为 SNPs,未能证实其与 CML之间存在相关性,但部分 SNPs的定位使其有可能对基因的转录和表达产生影响.     

NGAL基因3''''端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的将不同长度的NGAL基因3'端序列(包括外显子、内含子和部分3'侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素酶活力,确认NGAL 3'端序列中是否含有增强子或抑制子元件.方法应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1 880 bp)和F7(826 bp),将其克隆到pGEM-T easy载体,并测序验证;再亚克隆到pGL3-Promoter载体中,获得pGLP-F5和pGLP-F7表达载体;将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞,通过检测相对荧光素酶活力,确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件.结果我们成功构建了pGLP-F5和pGLP-F7重组载体.Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比,酶活力未表现出明显的增强或减弱.结论在本研究的实验条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不明显.     

BCR基因5''''启动子区多态性分析

背景与目的bcr-abl融合基因被认为是慢性髓系白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)的分子标志,该融合基因的表达受bcr基因启动子的调控。本实验目的是研究bcr基因启动子区的多态性,并探讨其与CML之间可能存在的联系。方法采用PCR方法扩增bcr基因5'启动子区1.13kb的序列范围,通过测序获得了30例CML和19例对照的启动子区序列。应用软件和在线工具对启动子序列进行转录因子结合位点分析和重复序列分析。结果在所研究片段范围内共发现4处新的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)和3处与参考序列不一致的碱基变异。其中2处SNPs和1处碱基插入位于转录因子结合位点中或邻近几个碱基内。各多态性基因频率在CML和对照人群中无统计学差异。结论bcr基因的5'启动子区存在一定的序列多态性,主要为SNPs,未能证实其与CML之间存在相关性,但部分SNPs的定位使其有可能对基因的转录和表达产生影响。