人胚髁状突软骨细胞的分离,培养和生物学性态

目的：研究体外培养的正常人胚髁状突软骨细胞的生物学特性。方法：体外培养人胚髁状突软骨细胞，观察其从原代至第６代的形态变化；测定细胞数量的变化及其生长曲线；测定冷冻复苏后的细胞存活；观察细胞的超微结构。结果：从原代至第３代，髁状突软骨细胞为圆形、多角形，从第４代开始逐渐转变梭形的成纤维细胞。体外培养至第６天髁状突软骨细胞的数量是接种时的３倍。冷冻复苏后经苔盼蓝拒染试验检查，发现细胞存活率为９２％。体     

培养状态下兔鼻软骨细胞生物学特性的研究

目的 :探讨体外培养的正常兔鼻软骨细胞分离培养方法及生物学特性。方法 :体外分离培养兔鼻软骨细胞 ,观察原代及传代培养的细胞形态学变化 ;测定细胞数量的变化及其生长曲线 ,观察细胞的增殖 ;借助特殊染色 ,免疫组织化学的方法了解葡萄糖胺聚糖 ,Ⅱ型胶原的合成情况 ;测定冷冻复苏后的细胞存活率。结果 :原代体外培养的新西兰白兔兔鼻软骨细胞初始接种时为圆形 ,细胞贴壁后逐渐变为多角形 ;组织学 ,免疫组化显示细胞培养 4代以内可以保持表型的稳定 ;冷冻复苏存活率为 93 %。结论 :体外培养的兔鼻软骨细胞表型能保持 4代稳定 ,具有正常的生长增殖能力 ,并可经深低温冷冻长期保存。     

颞下颌关节髁突软骨细胞体外培养中去分化现象研究

目的　研究去分化髁状突软骨细胞的细胞生物学特性。方法　连续在体外贴壁条件下培养传代正常乳兔髁突软骨细胞至第 2 0代 ,观察培养细胞的形态变化 ,免疫组化法和RT -PCR法对传代过程中的数代细胞对II型胶原与蛋白多糖聚糖体的表达情况进行连续检测 ,观察细胞软骨基质蛋白表达分泌的变化以及发生明显去分化软骨细胞的超微结构特点。结果　在贴壁培养条件下 ,髁状突软骨细胞去分化现象于细胞传代第 3代后逐渐显著 ,第 6代后培养的软骨细胞几乎完全去分化。去分化细胞胞体拉长 ,呈“成纤维细胞”样外观。去分化过程中 ,细胞对软骨基质蛋白的表达水平逐渐降低 ,细胞增殖速度增强。透射电镜观察显示 ,去分化软骨细胞细胞核明显呈分叶状 ,表现出异型核。结论　髁突软骨细胞在体外贴壁培养传代过程中会发生去分化现象 ,丧失软骨细胞特征性细胞表型。     

生长期兔髁突软骨细胞体外培养方法及其生物学特性研究

目的 建立髁突软骨细胞体外培养模型,研究其生物学特性。 方法 分离4周龄健康新西兰大白兔双侧髁突软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化方法收集4 h和12 h 2个时间点的髁突软骨细胞,连续体外培养并传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用甲苯胺蓝、阿利新蓝和免疫细胞化学染色对髁突软骨细胞进行鉴定;利用细胞计数绘制细胞生长曲线;通过Western 免疫印迹分析细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9在蛋白水平的表达情况。采用SPSS13.0软件包对Western 印迹条带灰度值进行统计学分析。 结果 兔髁突软骨细胞体积较大,呈纺锤形或多角形,铺路石样排列,细胞爬片染色结果为阳性。随着细胞传代“成纤维样”细胞比例逐渐加重,P2代之前的细胞形态差异较小。细胞生长曲线显示,兔髁突软骨细胞的体外培养符合经典的S形生长曲线。Western 印迹结果表明,4h和12 h所收髁突软骨细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9表达无显著差异。 结论 使用本方法培养兔髁突软骨细胞简单有效。髁突软骨细胞体外培养存在去分化现象,但P2代以内的髁突软骨细胞生物学特性相对稳定,适合用于后期实验研究,P3代以后的髁突软骨细胞逐渐丧失原有细胞的特性。     

下颌骨髁突软骨细胞传代过程中生物学特性变化

目的:观察体外培养及传代对人髁突软骨细胞生物学特性的影响。方法:采用体外细胞培养、免疫生化及分子生物学方法观察传代过程中人髁突软骨细胞形态、型胶原及蛋白多糖合成及、、型前胶原的mRNA水平变化。结果:传代过程中人髁突软骨细胞型胶原合成及其mRNA水平逐渐降低,至第7代已基本丧失。而、型胶原的mRNA水平随传代逐渐升高,同时伴有细胞蛋白多糖合成的减少,细胞壁形态由圆形或多角形转变为长梭形占优势。结论:体外培养及反复传代可影响软骨细胞的表型特征。髁突软骨细胞的反分化标准应从胶原、蛋白多糖合成及细胞形态等方面综合评价     

山羊颞下颌关节盘细胞体外培养研究

目的:研究山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞体外培养的生物学特性及其损伤修复的细胞学基础.方法:切取1 月龄山羊颞下颌关节盘, II型胶原酶消化获得关节盘纤维软骨细胞.逐日观察细胞的形态变化, 测定其生长曲线,甲苯胺蓝染色、I型胶原免疫组化染色鉴定.透射电镜观察细胞超微结构.结果:原代培养的关节盘纤维软骨细胞以长梭形为主, 部分多角形, 7 d即可传代.甲苯胺蓝染色阳性, I型胶原免疫组化染色胞质内可见棕黄色颗粒.超微结构显示细胞分为2 种,软骨细胞样细胞和成纤维细胞样细胞;线粒体、内质网发达.结论:体外分离培养的山羊颞下颌关节盘纤维软骨细胞具有较强的增殖能力,1～3代细胞可作为颞下颌关节盘组织工程的种子细胞.     

肝细胞生长因子基因转染兔髁状突软骨细胞及对其生物学特性的影响

目的观察携带有绿色荧光蛋白(gree fluorescent protein,GFP)标记的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)cDNA转染兔髁状突软骨细胞后的主要生物学特性。方法取兔髁状突软骨细胞体外培养至第2代,HGFcDNA转染软骨细胞,空白质粒组为对照组;噻唑蓝(MTT)检测软骨细胞的增殖能力,SABC免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达。结果髁状突软骨细胞在转染后可较长时间的保持其软骨细胞的生物学特性,并可促进软骨细胞的增殖,SABC免疫组化测第Ⅵ代软骨细胞的Ⅱ型胶原表达仍呈强阳性,而对照组软骨细胞则明显减弱,说明HGF基因转染软骨细胞后可表达其生物学功能。基因瞬间转染率大约为31.23%。结论GFP标记的HGF基因以脂质体为载体转染兔髁状突软骨细胞后可发挥其生物学功能,加速细胞的生长,在荧光显微镜下可直观地计算软骨细胞的瞬间转染率。     

细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究

目的 研究细胞冻存处理对髁突软骨细胞去分化特性的影响。方法 分离并体外培养2周龄新西兰大白兔双侧髁突软骨细胞, 将P1代冻存处理15 d后传代培养。采用倒置相差显微镜观察比较正常传代培养的P2代髁突软骨细胞（对照组）和经冻存处理后传代的P2代髁突软骨细胞（实验组）间的细胞形态;通过荧光定量PCR和Western免疫印迹技术检测和分析两组间软骨细胞标志物COL2、COL10、Sox9和Aggrecan基因和蛋白水平的表达差异,并使用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置相差显微镜观察发现实验组P2代髁突软骨细胞会出现一定程度的形态学改变;但是并未发现实验组和对照组之间COL2、COL10、Sox9和Aggrecan的表达有统计学意义的差异;实验组和对照组软骨标志基因的表达均会较P1代出现降低。 结论 体外培养髁突软骨细胞存在去分化现象,但细胞冻存处理并不会加速其去分化进程,所以体外培养的髁突软骨细胞可以通过冻存技术来实现髁突软骨细胞的暂存。     

永生化下颌髁突软骨细胞形态学特征的研究

目的:比较永生化下颌髁突软骨细胞(IMCC)和原代培养的下颌髁突软骨细胞(MCC)在形态学特征等方面的差别。方法:通过相差显微镜、光镜、电镜等观察细胞的形态特征,采用HPIAS-1000图像分析系统比较IMCC和MCC 的大小。结果:MCC表现出以多角形为主的多形性形态特征,并随培养代数的增加细胞形态发生改变;IMCC为多角形,传代对其形态无明显影响。MCC的超微结构表现出软骨细胞的一般特征, IMCC近似于前成软骨细胞,部分细胞核浆比例、细胞核形态发生改变。图像分析发现IMCC在细胞长短径、面积等方面小于MCC(P<0.01)。结论: IMCC基本保留了MCC的形态特征,其表型稳定,属于一种分化程度较低、幼稚的软骨细胞,可能近似于下颌髁突的增殖层细胞。     

人髁突软骨细胞培养及细胞库建立

目的　建立生物学性状稳定的髁突软骨细胞库 ,为颞下颌关节髁突软骨缺损及关节盘的生物性修复奠定基础。方法　髁突软骨取自因母体健康原因需终止妊娠的人胚胎 ,经机械分离及胰蛋白酶、胶原酶联合消化获得 ,应用微载体培养技术进行髁突软骨细胞的体外扩增 ,采用液氮深低温保存细胞 ,并定期 (2周、1个月 )对复苏软骨细胞生物学特性鉴定。结果　微载体培养技术可在短期内获得大量的、高成活率的髁突软骨细胞。经液氮冻存的软骨细胞在细胞增殖动力学、表型特征及细胞代谢方面无显著变化 ,基本上保持了原代培养软骨细胞的生物学特性。结论　成功的建立了髁突软骨细胞库 ,可为应用组织工程技术修复关节软骨缺损及重建关节盘的研究提供良好的供体细胞