大鼠脑皮质星形胶质细胞的原代培养、纯化及采用HCA技术进行GFAP鉴定

目的探索大鼠脑皮质星形胶质细胞(astrocyte,AS)的分离、原代培养及纯化方法,采用高内涵细胞成像分析技术(high content analysis,HCA)对其进行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定。方法取2、3 d的新生SD大鼠,体视显微镜下获取大脑皮质,机械分离成1 mm3组织碎块,采用质量分数为0.25%的胰蛋白酶和0.2%的胶原酶(体积比为1∶1)消化后进行体外培养,分别观察接种1 h、3 d、5 d后原代AS基本形态结构,酶消化3 min后,接种30 min,5 d后传代AS基本形态结构;采用多次、多阶段的差速贴壁和震荡相结合的方法纯化细胞;采用HCA技术对AS进行GFAP免疫细胞化学鉴定。结果采用本法培养的大鼠脑皮质星形胶质细胞,数量多、活性佳、纯度高,胞突丰富且细长,并相互交织成网,呈现典型而良好的生长状态;经本法纯化后的星形胶质细胞,细胞纯度明显提高;经HCA技术进行GFAP鉴定,AS纯度质量分数达98%以上,且图片质量佳。结论建立了一种大鼠脑皮质星形胶质细胞原代培养及纯化方法,采用高内涵细胞成像分析技术进行GFAP鉴定的图片质量明显优于传统方法,该技术值得推广和应用。     

大鼠脑星形胶质细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的分离、培养以及鉴定方法.方法 取出生1～2 d的Wistar大鼠大脑皮质,用机械法和胰酶消化法分散细胞,制成细胞悬液,差速黏附处理后,将未贴附的细胞接种培养.待细胞铺满瓶底后,置摇床摇晃,舍弃含脱落细胞的培养液,细胞传代.GFAP免疫细胞化学染色鉴定.结果 成功分离培养了原代星形胶质细胞,传代培养的星形细胞形态典型,纯度可达95%以上.结论 成功建立了大鼠星形胶质细胞体外培养方法.     

氯化锰诱导原代星形胶质细胞的过度活化

目的探讨氯化锰(MnCl_2)对于原代星形胶质细胞的影响。方法原代分离星形胶质细胞,培养后用星形胶质细胞特异性蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的抗体鉴定细胞,用不同剂量的MnCl_2处理24 h后MTT法检测星形胶质细胞的存活率,高内涵分析仪检测细胞面积和GFAP的表达,流式细胞仪检测细胞内ROS的变化。结果原代分离的细胞鉴定为星形胶质细胞,不同剂量的MnCl_2处理24 h后,星形胶质细胞的存活率随MnCl_2剂量的升高呈现剂量依赖性下降,细胞面积缩小,GFAP表达增加,细胞内ROS增多。结论 MnCl_2可以导致星形胶质细胞的过度活化。     

星形胶质细胞与神经退行性疾病的相关性

星形胶质细胞是脑内数量最多的胶质细胞,其总体积占脑总体积20%-50%,星形胶质细胞与神经元之间存在广泛而复杂的信息传递,以直接、相互作用的方式与神经元发生联系,在神经系统的发育、突触传递、调控信息处理与信号传递、离子平衡、调节神经和突触的可塑性等方面都发挥重要作用。星形胶质细胞在损伤状态下可以快速反应,转变为反应性星形胶质细胞,此时其保护功能己经丧失,反而会加剧损伤。反应性星形胶质细胞并非为"全或无"概念,而是经历了从可逆的基因表达改变、正常结构区域内的细胞肥大,到永久性胶质瘢痕形成、组织结构改变这一系列变化的星形胶质细胞的总称。胶质瘢痕的增殖多伴随着胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达增加,因此组织中GFAP升高是中枢神经系统对损伤作出反应的一个标志性信号。星形胶质细胞功能异常或退变严重破坏了星形胶质细胞-神经元之间的信息传递,导致神经元功能紊乱,诱发神经退行性疾病的产生,包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病及肌萎缩脊髓侧索硬化症。因此,星形胶质细胞绝不仅仅是神经退行性疾病中的配角,而是极其重要的参与者。阐明星形胶质细胞与神经退行性疾病的相关性可以为其有效药物的研发提供新的思路。     

Long Evans大鼠视皮层星型胶质细胞的体外培养

目的 建立星型胶质细胞体外培养体系,为体外研究星型胶质细胞的功能奠定基础.方法 无菌条件下取新生1～3 d的Long Evans(LE)大鼠视皮层,差速贴壁法除去成纤维细胞,摇床振荡法除去其他细胞,免疫荧光法对细胞进行鉴定.结果 分离培养的细胞具备典型的星型胶质细胞形态,表达了星型胶质细胞特异性抗原GFAP,并能分泌硫酸软骨素.结论 该方法培养的星型胶质细胞具有正常的形态和功能,可用于星型胶质细胞的体外功能研究.     

哌替啶不同给药时程对SD大鼠齿状回星形胶质细胞形态和GFAP表达的影响

目的 观察哌替啶不同给药时程对SD大鼠齿状回星形胶质细胞形态和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法 成年SD大鼠24只随机分为对照(C)组、单次给药1d处死(D1)组、重复给药7 d处死(D7)组和重复给药14 d处死(D14)组.各组在末次给药24 h后经心脏灌注取脑.免疫组化检测GFAP,共聚焦显微镜观察、测定齿状回GFAP阳性星形胶质细胞的数量及体视学参数.结果 D1组GFAP表达水平增加,平均细胞面积减小,细胞个数增加,细胞形态复杂,侧枝增多;D7组GFAP表达水平较D1组有所下降,但仍高于C组,细胞的侧枝开始减少;而D14组GFAP表达水平与C组相仿,细胞胞体皱缩,面积缩小,侧枝更少.结论 哌替啶不同给药时程对SD大鼠齿状回星形胶质细胞形态和GFAP表达的影响不尽相同.     

丙泊酚对新生大鼠脑皮层星形胶质细胞凋亡的影响

目的研究丙泊酚对新生大鼠脑皮层星形胶质细胞凋亡的影响及其机制。方法原代分离和培养AST细胞,用GFAP免疫细胞化学鉴定。不同浓度丙泊酚(0、10、30、90μmol·L-1)作用AST细胞8 h。MMT法检测细胞生存率;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡;Western blot法测定线粒体cyt-C漏出;分光光度计法检测caspase-3和caspase-9活性。结果分离培养出原代AST,不同浓度丙泊酚(0、10、30、90μmol·L~(-1))浓度依赖性地降低AST细胞生存率,诱导细胞线粒体cyt-C漏出,上调促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9,诱发AST凋亡。结论丙泊酚在体外能诱发新生大鼠脑皮层星形胶质细胞凋亡,其机制可能与丙泊酚诱导线粒体cyt-C释放,激活线粒体凋亡通路有关。     

青蒿素抑制星形胶质细胞炎症通路的分子机制研究

目的 分别以P2X7、外泌体以及瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)为作用靶点,研究青蒿素(ART)抑制星形胶质细胞炎症通路的分子机制。方法 培养小鼠原代星形胶质细胞,利用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞的纯度;MTT法检测ART对细胞活性的影响;脂多糖(LPS)处理原代星形胶质细胞,构建细胞炎症模型;分为空白对照组,ART组,外泌体抑制剂组,P2X7受体抑制剂组,TRPV1受体抑制剂组,TRPV1受体激动剂组,通过ELISA法和吸光光度法检测细胞上清液中炎症因子的含量(TNF-α、IL-1β、IL-6及NO)。结果 GFAP阳性细胞数达95%表明成功分离培养小鼠原代星形胶质细胞;300 ng/mL的LPS处理12 h是刺激星形胶质细胞构建炎症模型的最佳浓度和时间;10μmol/mL的ART处理12 h可以达到最佳的抗炎效果,并且当浓度小于20μmol/mL时,对细胞活性基本无影响;抑制P2X7受体的表达和外泌体的释放均能降低细胞中炎症因子TNF-α的含量,但不能与ART产生协同降低的效果;抑制TRPV1受体增加了细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6以及N...     

免疫磁珠法结合条件培养基进行低密度条件下的神经元原代培养

目的利用免疫磁珠(IMB)细胞分选技术结合星形胶质细胞条件培养基(A-CM)进行低密度条件下原代神经元培养。方法取新生(24 h)内昆明小鼠取大脑半球,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液进行原代培养。培养10 d后,利用恒温振荡法去除小胶质细胞等杂细胞,抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞纯度。利用达到纯度要求的细胞培养物制备A-CM。分别取新生(24 h)内昆明小鼠大脑皮质和海马,通过机械分离与胰酶消化制备细胞悬液,经IMB细胞分选获得高纯度神经元,加入A-CM进行低密度条件下神经元的原代培养。观察培养过程中神经元的形态学指标,以抗160 ku神经丝抗体免疫荧光染色鉴定神经元纯度。结果细胞免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞的纯度>95%。小鼠皮质和海马神经元形态学观察与细胞免疫荧光染色结果表明,神经元在低密度培养条件下生长良好,不同发育阶段的形态学特征明显,纯度较高。结论低密度条件下成功培养了小鼠大脑皮质和海马原代神经元。     

神经胶质细胞与突触可塑性关系的研究进展

突触可塑性与神经系统的发育、损伤后修复等密切相关。神经胶质细胞通过能量物质传递、信号转导通 信等方面与神经元保持密切交流,是促进突触可塑性的重要途径。星形胶质细胞在形态上和功能上均与突触联系 密切,是调控突触可塑性的重要影响因素;小胶质细胞与突触进行双向信息交互,是发育和成年期突触可塑性的关 键调节因子;少突胶质细胞参与髓鞘形成,为突触传递提供代谢底物,是促进突触可塑性的潜在力量。就星形胶质 细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞与突触可塑性关系的相关研究进展进行综述,以期为深入认识神经胶质细胞与 突触可塑性的相互关系提供参考。     

星形胶质细胞功能障碍与抑郁症研究进展

目前关于抑郁症的研究大多围绕神经元进行调控,而星形胶质细胞对抑郁症调控的非神经元机制尚未深入研究。星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多、分布最广泛的胶质细胞,其结构和形态复杂,与神经突触、血管和其他神经胶质细胞相互调节,在多种神经精神系统疾病的发病和治疗中发挥重要作用。有研究显示,星形胶质细胞可能通过调节单胺递质水平、谷氨酸循环、突触可塑性、能量代谢和神经炎症等参与抑郁症的发生。本文就此进行综述,以期为抑郁症胶质细胞病理机制的发现和基于星形胶质细胞调控的新一代药物研发提供新思路。     

非接触式共培养体外血脑屏障模型的跨膜电阻及通透性

目的建立大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCEC)与星形胶质细胞共培养血脑屏障模型并评价其功能。方法采用SD大鼠原代分离培养获得BCEC和星形胶质细胞。经细胞形态学观察、免疫组化检测相关抗原后建立非接触式共培养血脑屏障模型,测定共培养模型所形成的跨细胞电阻及荧光素钠的通透性。采用LC-MS检测6个化合物透过血脑屏障模型的通透性,并与文献报道的体内数据进行比较。结果培养的BCEC多数为短梭形外观,免疫组化检测可见细胞高表达因子Ⅷ;星形胶质细胞呈现具有细胞突起的典型形态,免疫组化检测可见细胞高表达胶质纤维酸性蛋白。共培养的体外血脑屏障模型跨BCEC单层的电阻值为(373±41)Ω·cm2,荧光素钠跨BCEC单层的通透性为(0.34±0.14)×10-3cm·min-1,符合体外血脑屏障模型要求。对所选6个化合物体内外透过BBB模型渗透系数的比较,表明具有一定的相关性(R2=0.7679,P<0.05)。结论建立的体外BBB模型在跨内皮电阻和通透性方面具备了在体BBB的基本特性,可以用于模拟体内环境,进行药物早期筛选方面的研究。     

乳黄片对高氨环境中星形胶质细胞CRL-2541活力及GFAP表达的影响

目的 探讨乳黄片脑脊液对高氨环境中星形胶质细胞活力和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响. 方法 运用中药脑脊液药理学方法 把体外培养的CRL-2541细胞分为空白对照组、氨损伤组、正常脑脊液（CSF）组、乳黄片脑脊液组,各组加入不同溶液. MTT检测CRL-2541活力,免疫细胞染色法检测GFAP表达情况. 结果 乳黄片脑脊液能升高高氨环境中受损细胞CRL-2541的吸光度,上调GFAP的表达. 结论 乳黄片能进入血 脑脊液屏障,对高氨环境中受损的星形胶质细胞有保护作用,提示其抗肝性脑病的作用位点可能为星形胶质细胞.     

京尼平苷对LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应的抑制作用

目的明确京尼平苷对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应的抑制作用。方法以LPS诱导原代培养的星形胶质细胞为细胞模型,随机分为对照组、LPS组、LPS+白藜芦醇组和LPS+不同浓度京尼平苷组,采用Western Blot法检测星形胶质细胞活化标记物GFAP水平及NF-κB p65水平,ELISA法检测致炎细胞因子水平。结果京尼平苷可显著抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化,降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,同时NF-κB p65蛋白的表达也明显降低。结论京尼平苷能通过NF-κB途径抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化,并抑制致炎细胞因子水平。     

星形胶质细胞-神经元的相关关系研究进展

星形胶质细胞在神经系统中的作用类似于调控者,信息传递者和区域划分者,更多时候它是感受神经元活动并作出相应反应,比如监控并摄入多余神经递质并把信息传递给小胶质细胞和少突胶质细胞,对这部分神经元进行选择,是否突触修剪、是否完成髓鞘化、使电传递稳定和筛选出优势传导通路。它类似于外周的纤维细胞,支持与营养作用是被动的。星形胶质细胞和神经元的关系已成为神经生物学中的热点。目前对星形胶质细胞和神经元相互作用主要包括能量代谢、突触可塑性和谷氨酸循环等。星形胶质细胞在一定应激条件下,由静息性星形胶质细胞向反应性星形胶质细胞转变;还可以通过特定的转录因子(例如Neuro D1,Sox2等)在体外以及体内转变为神经细胞。神经元分泌的Sonic hedgehog(Shh)、星形胶质细胞分泌的TGF-β1和Chrdl1等均相互影响彼此。神经连接蛋白(Neuroligin)如蛋白NL1,NL2和NL3的水平与星形胶质细胞的大小和形状成正向调节。因此,本文主要从星形胶质细胞和神经元之间的关系,包括相互作用、转化作用、分泌物和其蛋白相互影响等进行综述。     

大鼠脑微血管内皮细胞与周细胞、星形胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型

目的应用原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞(brainmicrovessel endothelial cells,BMECs)与脑微血管周细胞(brain-microvessel pericytes,BMPC)、星形胶质细胞(astrocytes,AS)共培养建立可模拟在体状态的体外血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)模型。方法原代分离、纯化和培养大鼠BMECs、BMPC和AS,通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞,应用Millicell细胞培养插(孔径0.4μm)建立5种不同类型的体外BBB模型,经跨内皮电阻值(transendothelial electrical resistance,TEER)、荧光素钠通透性(sodium fluorescent,Na-FLU)、碱性磷酸酶(AKP)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT1)的表达测定以及阳性药在体内和体外BBB通透量的相似性,比较评价其屏障功能。结果原代培养的BMECs呈典型的铺路卵石样结构,BMPC胞体较大且呈分枝状,AS有细长突触,胞质较浅;免疫细胞化学染色证实原代细胞为目标细胞;BMECs与BMPC、AS共培养后TEER值可达(478±25)Ω·cm2,Na-FLU的表观渗透系数为[(8.23±0.78)×10-6]cm·s-1,AKP和γ-GT1表达分别为(6.90±0.27)金氏单位·g-1Pro,(4.39±0.32)μg·g-1Pro;阳性药在体外BBB的表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)与在体数据具有较好的相关性(R2=0.92)。结论原代培养的大鼠BMECs与BMPC、AS共培养建立的体外BBB模型在形态、结构及屏障功能方面具备BBB的基本特征,为研究BBB的生理学、病理学以及筛选化合物提供了一种有用工具。     

TGF-β1-Samd3信号转导在星形胶质细胞增殖中的作用

目的探讨TGF-β1对体外培养的星形胶质细胞增殖的影响及其Smad3信号转导机制。方法体外培养的原代星形胶质细胞,传代接种后采用SiRNA基因沉默技术,干扰Smad3基因的表达,RT-PCR验证沉默效果,应用免疫荧光技术观察干扰TGF-β1-Smad3通路后对星形胶质细胞增殖的影响。结果 TGF-β1对星形胶质细胞增殖有明显促进作用,并呈现一定的剂量依赖性;成功沉默Smad3基因后,星形胶质细胞的增殖率明显减低;成功沉默Smad3基因能干扰TGF-β1对星形胶质细胞增殖的促进作用。结论 TGF-β1-Smad3信号转导通路对星形胶质细胞增殖起调节作用。     

胍丁胺对慢性应激大鼠海马神经元和星形胶质细胞的影响

目的在海马神经元和星形胶质细胞水平探讨胍丁胺抗抑郁作用机制。方法采用多种应激方式建立大鼠慢性应激抑郁模型,通过开场实验和蔗糖饮水实验观察模型组、阳性对照药氟西汀组(10 mg.kg-1,ig)和胍丁胺组(20 mg.kg-1,ig)大鼠的行为学变化;应用神经元标志物——微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)和星形胶质细胞标志物——胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)免疫组织化学染色,观察各组大鼠海马神经元和星形胶质细胞形态改变。结果慢性应激模型组大鼠开场实验水平运动得分和垂直运动得分明显降低,蔗糖偏嗜度明显降低,氟西汀和胍丁胺可逆转此变化;免疫组化结果显示,慢性应激模型组MAP2和GFAP表达明显减弱,表现为海马神经元突起长度和数目以及星形胶质细胞的数量和突起数量明显降低,氟西汀和胍丁胺可改善此病理变化。结论海马神经元和星形胶质细胞共同参与抑郁症发生,胍丁胺可逆转慢性应激引起的细胞形态结构改变,发挥抗抑郁作用。     

体外培养新生大鼠星形胶质细胞在缺氧缺血损伤时β1整合素的表达变化

目的 了解缺氧缺血损伤时星形胶质细胞分泌β1整合素的变化.方法 采用免疫激光共聚集的方法检测体外培养的星形胶质细胞在缺氧缺血不同时段β1整合素的表达.结果 星形胶质细胞缺氧缺血12h、24h β1整合素表迭减少,细胞逐渐凋亡.结论 缺氧缺血损伤时星形胶质细胞合成β1整合素减少,可破坏细胞正常结构形态.     

鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ对星形胶质细胞cGMP及GFAP的影响

目的分析星形胶质细胞中cGMP浓度变化对GFAP表达影响,探讨NO-sGC-cGMP信号转导系统对星形胶质细胞活化机制。方法分离纯化SD乳鼠大脑皮层细胞,经原代及传代培养,随机分成8组,经ODQ干预后,放射免疫测其cGMP浓度,同时免疫荧光测GFAP荧光强度OD值,代表GFAP表达强度,统计学作相关分析。结果sGC选择性抑制剂ODQ干预后,随着cGMP浓度降低,GFAP表达量也随之降低,其相关系数为0.76(P=0.036)。结论cGMP浓度与GFAP合成呈高度正相关。结合NO-sGC-cGMP信号传导途径,该途径可能对GFAP的合成具有调节作用。