抗坏血酸体外诱导人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化

目的 探讨抗坏血酸作为诱导剂诱导人胚胎生殖细胞(hEGC)体外分化为心肌细胞.方法 取5～10周人胚胎生殖腺嵴,进行组织块体外培养,用直接悬浮法使hEGC形成拟胚体(EBs),用不同浓度抗坏血酸的培养基对其进行诱导分化.然后取不同时间的细胞做免疫细胞化学染色,鉴定细胞的心肌特异转录因子GATA-4和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达情况.结果 抗坏血酸诱导hEGC分化为心肌细胞的最佳浓度为0.1 mg/ml,诱导第3周时分化率达(85.2±1.8)%,显著高于不添加任何诱导剂的对照组.诱导后细胞形态变成梭形,4周时细胞突起相互连接成条索状,且排列方向趋于一致;诱导后1周即开始出现GATA-4弱表达,第3周时表达最强;诱导后2周,细胞内开始表达cTnT,3周强阳性表达,4周表达明显增强.结论 抗坏血酸能够促进hEGC向心肌细胞分化,可用以建立体外诱导hEGC分化为心肌细胞的方法.     

lncRNA IGF2-AS调控IGF2对骨髓间充质干细胞 心肌样分化的影响

目的 探讨长链非编码RNA胰岛素样生长因子2反义转录物（lncRNA IGF2-AS）调控胰岛素样生长因子2 （IGF2）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）心肌样分化的影响。方法 分离培养SD大鼠的BMSCs,倒置显微镜观察原代 细胞、第3代细胞的形态;流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD45的表达。将第3代生长良好的BMSCs 分为对照组、空载体组（转染pLVX-IRES-Zs Green1载体）、lncRNA IGF2-AS组（转染pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2- AS）、5-氮杂胞嘧啶（5-AZA）组（8 μmol/L 5-AZA 处理）、si-NC 组、si-IGF2-AS 组、si-IGF2 组、lncRNA IGF2-AS+siNC 组及 lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 组。实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 IGF2-AS 表达;MTT 法检测细胞活力; Western blot检测IGF2、间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）蛋白表达;RNA下拉 和RNA免疫沉淀（RIP）检测IGF2-AS与IGF2蛋白结合情况。结果 原代细胞在培养初期呈悬浮状态,大多数呈圆 形,培养48 h后开始贴壁生长;第3代细胞呈长梭形,排列不整齐,相邻细胞间紧密连接,呈成纤维细胞样。第3代 BMSCs 高表达 CD29（98.21%）、CD90（92.54%）,低表达 CD45（3.67%）。过表达 IGF2-AS 或 5-AZA 处理均可促进 BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表达,并降低细胞活力,且 5-AZA 组相应指标明显低于 lncRNA IGF2-AS 组（P＜ 0.05）。沉默IGF2-AS或抑制IGF2表达均可降低BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表达,并降低细胞活力（P＜0.05）; lncRNA IGF2-AS可靶向上调IGF2蛋白的表达（P＜0.05）;沉默IGF2逆转了过表达IGF2-AS对BMSCs心肌样分化的 促进作用。结论 过表达IGF2-AS通过上调IGF2促进BMSCs心肌样分化。     

人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外分离纯化、培养扩增和向心肌样细胞诱导分化的条件。方法：体外分离培养hMSCs,纯化传代至第三、四代,加入不同浓度5-氮杂胞苷（5-Aza）进行不同时间的孵育,用MTT测定细胞的生长活性,确定最佳的浓度和孵育时间。4周后行电镜,免疫组化染色及逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。结果：诱导后细胞呈心肌样细胞改变,电镜下可见肌丝形成,免疫组化显示部分细胞胞浆α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、肌钙蛋白-T（troponin-T）阳性。RT-PCR检测显示心肌特异转录因子GATA-4、Nkx2.5有表达。结论：hMSCs是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在5-Aza的诱导下可向心肌样细胞分化,可成为心肌损伤移植治疗的理想细胞材料。     

转化生子因子β1对培养心脏成纤维细胞α-SMA及Cx43表达的影响

目的：本研究拟观察转化生子因子β1（TGFβ1）诱导乳鼠CFs向MFs分化中α—SMA及Cx43表达的影响。方法：酶解-差速贴壁分离法分离培养乳鼠CFs,将10ng／mL的TGFβ1诱导培养第1天细胞;细胞免疫荧光及共聚焦纤维观察α—SMA及Cx43表达;以免疫印迹和RT—PCR分别半定量比较两者a—SMA及Cx43蛋白和mRNA表达。结果：分离培养2d的原代CFs细胞极少表达a-SMA及Cx43蛋白及其mRNA;经TGFβ1诱导24h后α—SMA及Cx43蛋白及其mRNA表达显著增高（P〈0．01）。结论：TGFβ1,可诱导乳鼠CFs向MFs分化,导致α—SMA及Cx43蛋白及其mRNA表达显著增高。     

过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激中心肌蛋白变化规律的研究

目的探讨过氧化氢(H2O2)诱导心肌细胞氧化应激中心肌蛋白的变化规律。方法采用原代分离小鼠心肌细胞,H2O2刺激心肌细胞,分别于不同浓度H2O2刺激不同时段后,采用MTT法分析细胞活力变化,流式细胞仪测定细胞凋亡情况,ELISA试剂盒测定细胞内GSH和MDA水平,并采用蛋白印迹方法测定心肌细胞内心肌蛋白心肌肌钙蛋白T(cTnT)和间隙连接蛋白43(connexin 43)的变化规律。结果高浓度H2O2较低浓度降低心肌细胞细胞活力显著,H2O2刺激2h后细胞活力降低显著(P<0.05);高浓度H2O2刺激2h后细胞凋亡率显著升高(P<0.05);H2O2刺激减少心肌细胞谷胱甘肽(GSH)水平,增加丙二醛(MDA)含量(P<0.05);H2O2刺激增加心肌细胞内cTnT和connexin 43蛋白表达,呈现一定量效关系。结论 H2O2刺激心肌细胞,可抑制心肌细胞活力,促进细胞凋亡,造成心肌细胞氧化应激损伤,H2O2引起心肌细胞内cTnT和connexin 43表达代偿增高。提示减少氧化应激,提高抗氧自由基防御机制与疾病转归密切相关。     

磷酸肌酸钠对阿霉素所致心肌损伤大鼠急性期心肌组织连接蛋白43表达的影响

目的探讨磷酸肌酸钠对阿霉素所致心肌炎大鼠急性期心肌组织连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探讨磷酸肌酸钠对阿霉素所致心肌炎并发心律失常发挥作用的机制。方法 60只雄性SD大鼠分为磷酸肌酸钠干预组,阿霉素组和正常对照组,观察大鼠的一般情况,第14天无痛苦处死全部大鼠并留取心脏。免疫组织化学法检测Cx43蛋白水平表达,并进行定量分析。结果①阿霉素组大鼠心室肌组织炎症病灶中变性、坏死周围心肌细胞Cx43表达明显减弱,甚至阴性,分布不规则,Cx43蛋白表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。②磷酸肌酸钠组Cx43蛋白表达明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论阿霉素所致心肌损伤大鼠急性期心肌组织Cx43蛋白表达下降。磷酸肌酸钠能明显提高CVB心肌炎大鼠急性期心肌组织Cx43蛋白表达。     

骨髓间充质干细胞移植改善缺血心脏功能

目的 探讨骨髓间充质干细胞移植改善缺血心脏功能的机制.方法 以近交系F344大鼠为研究对象,结扎冠状动脉制作大鼠心肌梗死模型,1周后将BrdU标记的骨髓间充质干细胞移植于心梗缺血区,4周后缺血心肌切片,通过免疫组织化学染色检测BrdU、闰盘连接蛋白(connexin 43,Cx 43)、肌球蛋白重链β(MHC)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,了解移植细胞的分化情况,并应用超声检测大鼠心脏功能的变化.结果 超声检查显示治疗组心功能明显改善,心脏射血分数(EF)值增加了(27.85±4.00)%,而对照组减少了(1.98±2.87)%,差异有统计学意义.心肌缺血区内可见到BrdU标记的移植细胞,相当一部分移植细胞已分化为MHC和Cx 43染色阳性的心肌样细胞.同时,治疗组功能血管密度较对照组明显增加.结论 骨髓间充质干细胞移植于缺血心肌后可分化为心肌样细胞,参与改善缺血心脏的功能.     

PTEN调节神经样细胞微管相关蛋白tau的聚集及意义

目的观察体外诱导成人骨髓基质干细胞(BMSC)向神经细胞分化过程中,在第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)调节细胞骨架中轴突标志分子微管相关蛋白tau(MAPT)分布及聚集的特征,并探讨其意义。方法从成人骨髓中分离基质干细胞,在体外经细胞因子诱导分化2周后成为神经样细胞,将未分化的BMSC作为对照组;应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法研究MAPT的表达变化;经PTEN抑制剂BPV作用于该细胞后,用结合有荧光剂的鬼笔环肽直接染色细胞微丝肌动蛋白,并联合用免疫荧光细胞化学方法染色MAPT,在激光共聚焦显微镜下观察MAPT和肌动蛋白的定位及关联性。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导分化后,MAPT的m RNA在分化1周和2周时相对表达水平为0.24±0.04和0.52±0.04,高于对照组BMSC的0.04±0.02(P<0.05)。MAPT蛋白表达水平分别为0.18±0.03和0.44±0.05,高于对照组0.06±0.04(P<0.05)。细胞染色后,经BPV作用后MAPT由弥散状态变为聚集状态,并分布于细胞一侧,神经样细胞开始出现极性。结论 BMSC来源的神经细胞分化成熟时,PTEN参与调节细胞骨架中轴突标志分子MAPT的转运和聚集,为神经细胞的轴突进一步生长提供物质支持。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的基因表达

为观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞（MSCs）转化为心肌样细胞的ANP、BNP、α—skeletal actin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2．5基因表达,取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓;利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的MSCs细胞表面抗原进行测定。应用10μmol／L5-氮胞苷对第2代的MSCs诱导24h,于诱导后1、2、3、4周,用逆转录-聚合酶链反应（PCR）检测ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2．5基因表达。结果表明,3份第2代MSCs样本重复测定,表达CD29、CD44,不表达CD34、CIM5。以5-氮胞苷诱导培养24h后,MSCs形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭形,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。诱导组细胞ANP、BNP、α—skeletalactin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2．5的PCR产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性;诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论：5-氮胞苷可诱导MSCs向心肌样细胞转化,处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间,并可能具有心肌细胞的功能。     

杜鹃素通过降低Cx43的表达抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖

目的研究Cx43在杜鹃素抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用。方法体外培养原代大鼠VSMCs细胞,随机分为对照组、AngⅡ刺激组(模型组)、AngⅡ+杜鹃素组(给药组)。CCK-8法检测细胞活力,Ed U法检测细胞增殖活性,流式细胞术观察细胞周期,real-time PCR和Western blot法检测细胞中Cx43的表达。用si RNA干扰Cx43的表达并测定细胞Ed U结合率和细胞周期。结果浓度为60μmol·L^-1的杜鹃素可使AngⅡ诱导的大鼠VSMCs的细胞增殖活性和Ed U结合率均明显降低(P<0.05),并阻止VSMCs由G0/G1期向S期的转化。Real-time PCR和Western blot结果显示,与模型组比较,杜鹃素能明显降低Cx43的m RNA和蛋白表达水平(P<0.01)。用si RNA干扰Cx43的表达后,杜鹃素对AngⅡ诱导的VSMCs增殖的抑制作用明显减弱。结论杜鹃素可明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖,抑制VSMCs有丝分裂,使其停滞于G_0/G_1期,其作用可能与杜鹃素抑制Cx43的表达有关。     

Cx43对脑胶质瘤C6细胞增殖的影响及机制

目的将p CMV-Cx43c DNA重组质粒转染入大鼠脑胶质瘤C6细胞,上调C6细胞Cx43表达,进而探讨C6细胞Cx43过表达对其增殖能力的影响及机制。方法通过脂质体将p CMV-Cx43c DNA重组质粒转入C6细胞,使C6细胞过表达Cx43,并用G418筛选出稳定过表达Cx43的C6细胞;测定细胞倍增时间和软琼脂集落形成实验,检测各组细胞的增殖程度;分别用ERK1/2特异性阻断剂PD98059(30μmol·L~(-1))、p38MAPK特异性阻断剂SB20219(10μmol·L~(-1))处理各组细胞,Western blot检测各组细胞Cx43、p-Cx43、pERK1/2和p-p38MAPK的表达;MTT比色法检测各组细胞活性。结果成功将p CMV-Cx43c DNA重组质粒转入C6细胞,并筛选出稳定转染Cx43基因的C6细胞;测定细胞倍增时间和软琼脂集落形成实验表明C6-Cx43组比C6组、C6-p CMV组细胞增殖速度减慢,细胞集落数明显减少(P<0.01);ERK1/2、p38MAPK特异性阻断剂处理细胞后,Western blot检测发现C6-Cx43+PD98059组、C6-Cx43+SB202190组较C6-Cx43组Cx43表达升高(P<0.01)、pCx43(P<0.05)表达下调。结论阻断ERK1/2、p38MAPK通路,导致Cx43蛋白表达升高,从而抑制C6细胞的增殖。     

PKC及缝隙连接蛋白Cx43改变在吗啡和舒芬太尼预处理缺氧复氧损伤心肌中的作用

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）信号通路及心肌缝隙连接蛋白Cx43改变在阿片药物预处理中的作用。方法：原代心肌细胞分离培养。将培养5 d的心肌细胞分成8组。正常对照组（C组）不给予任何处理,建立培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型（I/R组）,吗啡组（MF组）加入吗啡至终浓度0.3 μmol·L^-1,舒芬太尼组（SF组）加入舒芬太尼至终浓度0.000 3 μmol·L^-1,PKC激动剂PMA+吗啡组（PMA+MF组）加入PMA至终浓度0.02 μmol·L^-1,再进行吗啡预处理;PKC抑制剂Rottlerin+吗啡组（ROT+MF组）加入Rottlerin至终浓度5 μmol·L^-1,再进行吗啡预处理;PKC激动剂PMA+舒芬太尼组（PMA+SF组）加入PMA至终浓度0.02 μmol·L^-1,再进行舒芬太尼预处理;PKC抑制剂Rottlerin+舒芬太尼组（ROT+SF组）加入Rottlerin至终浓度5 μmol·L^-1,再进行舒芬太尼预处理。各组做上述相应处理后取材检测细胞存活率。免疫荧光共聚焦技术检测缝隙连接蛋白Connexin 43（Cx43）的平均光密度（AOD）,用Western-blot检测细胞Cx43总蛋白及其磷酸化水平（P-Cx43）的表达量。结果：与C组比较,其余各组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、心肌细胞Cx43总蛋白表达及P-Cx43表达降低（P<0.05）;与I/R组比较,MF组、SF组、ROT+MF组、ROT+SF组、PMA+MF组、PMA+SF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达增高（P<0.05）;与MF组比较,ROT+MF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、Cx43总蛋白及P-Cx43表达降低（P<0.05）,SF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值和Cx43总蛋白降低（P<0.05）,而P-Cx43表达增高（P<0.05）,PMA+MF组心肌细胞存活率、Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达均增高（P<0.05）;ROT+SF组较SF组心肌细胞Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达低（P<0.05）,而PMA+SF组较SF组心肌细胞存活率、心肌细胞Cx43 AOD值、Cx43总蛋白和P-Cx43表达高（P<0.05）。结论：吗啡和舒芬太尼预处理可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,且吗啡对心肌细胞的保护作用较舒芬太尼强,这种心肌细胞保护作用可能与PKC信号通路的激活有关。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

目的通过分离、培养脂肪间充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源。方法胶原酶消化分离成人脂肪来源的间充质干细胞并进行传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CD29、CD31、CD34、CD44及细胞周期,MTT绘制细胞生长曲线。用第3代细胞进行诱导分化,观察不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza,1,3,5,10,15,20μmol/L)及不同作用时间(12,24,48,72h)诱导其向心肌细胞分化的差别,采用最佳浓度10μmol/L,最佳作用时间24h进行实验,分别在第7,14,21,28天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌、肌球蛋白重链(MHC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达,第14天反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌发育相关基因NKX2.5的表达。结果倒置相差显微镜下观察原代细胞,可见细胞呈梭型、核圆形或椭圆形,偶见双核。传代细胞核原代细胞形态相似,排列有了一定的方向性。流式细胞仪检测结果显示,第1、3、5代细胞均高表达CD29和CD44;而CD31始终表达很弱,可认为呈阴性表达;CD34在第1、3代细胞弱表达,在第5代细胞表达逐渐减弱为阴性。细胞生长曲线显示前3d处于细胞潜伏状态,第4天进入对数生长期,第10天达到顶峰。细胞周期检测结果显示G1期细胞为85.93%,S期为7.24%,G2期为6.83%。10μmol/L5-Aza诱导后7d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌、MHC、cTnI表达。14d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,cTnI阴性表达。21d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并可见少量cTnI阳性表达。28dα-横纹肌、MHC、cTnT阳性表达数目均增多,RT-PCR结果显示NKX2.5呈阳性表达。结论成人脂肪中可以分离出脂肪间充质干细胞并且可以在体外培养传代,经过5-Aza的诱导可以向心肌细胞分化,为干细胞移植治疗和组织工程学种子细胞提供了更多的选择。     

孕期LPS刺激对子代6周龄大鼠血管结构的影响

目的研究孕期炎症刺激剂脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激对子代大鼠6周龄时血管结构的影响。方法 12只Sprague dawley(SD)孕鼠随机分为3组:对照组(control,Con)、LPS刺激组、LPS刺激加二硫代氨基四氢呋喃(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)干预组(L+P),分别在孕8~14 d腹腔注射生理盐水、LPS(0.79 mg·kg~(-1))或LPS加PDTC(100 mg·kg~(-1)),LPS于孕d 8、10、12给药;生理盐水及PDTC于d 8~14每天给药。子代出生6周测体质量;透射电镜观察血管超微结构;实时荧光定量PCR检测仔鼠胸主动脉连接蛋白(connexin,Cx)Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的mRNA表达水平;Western blot和免疫荧光检测仔鼠胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的蛋白表达水平。结果与Con组相比,LPS组子代大鼠在6周时♂♀体质量均明显增加(P<0.01);L+P组♂鼠明显低于LPS组(P<0.05),而♀鼠差异无显著性。LPS组内皮受损,内皮细胞间可见明显缝隙连接(gap junction,GJ),相对于Con组较长且多见;L+P组内皮损伤程度较LPS组稍有改善。LPS组Cx43 mRNA及蛋白表达均明显低于Con组(P<0.05),L+P组则明显高于LPS组(P<0.05);Cx37、Cx40和Cx45各组间mRNA及蛋白表达差异无统计学意义。LPS组Cx43荧光强度及荧光点数明显比Con组降低,而L+P组明显比LPS组高,各组间Cx37、Cx40和Cx45荧光强度和荧光点数并无明显差异。结论孕期LPS刺激可致子代大鼠在6周龄时出现血管结构损伤,这种损伤可能持续于新生儿期,并与其成年发生高血压密切相关。     

干预NRG-1/ErbB通路对大鼠脂肪干细胞向类窦房结细胞分化的影响

目的探讨在大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向心肌样细胞分化的一定时期内,通过干预NRG-1/ErbB通路是否可调控其向类窦房结样细胞或工作肌样细胞分化。方法分离培养大鼠ADSCs,免疫荧光测定细胞相关表面抗原鉴定其干细胞特性。取3代ADSCs加入含10μmol.L-15-氮胞苷(5-Aza)和10μg.L-1bFGF的培养基处理24 h后分3组向心肌样细胞诱导分化,包括对照组、AG1478组、神经调节蛋白-1(NRG-1)组,取正常培养的为ADSCs组。诱导3周后,通过RT-PCR检测各组NKx2.5、HCN4、TBX3、TBX2基因,Westernblot检测TBX3蛋白,膜片钳检测各组动作电位的表达差异。结果 ADSCs加5-Aza诱导3周后表达心脏早期转录因子Nkx2.5及肌钙蛋白,证明5-Aza可以将ADSCs诱导成心肌样细胞。而AG1478组起搏相关基因(HCN4、TBX3、TBX2)的表达明显强于对照组及NRG-1组(P<0.05),TBX3蛋白也强于对照组(P<0.05),并能产生窦房结样动作电位。而NRG-1组Nkx2.5的表达高于对照组及AG1478组(P<0.05),亦能检测到心室肌样动作电位。结论在大鼠AD-SCs向心肌样细胞分化的一定时间内通过干预NRG-1/ErbB通路可使其定向分化为起搏样细胞或工作肌样细胞,这为今后干细胞生物起搏研究做了有益探讨。     

二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达的影响

目的研究二甲双胍(metformin,Met)对高糖培养下的H9c2细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)表达的影响及其机制。方法高糖培养的大鼠H9c2心肌细胞分别加入3和5μmol·L-1的两种不同浓度的二甲双胍继续培养24 h。MTT实验检测H9c2细胞活力;LDH释放实验检测细胞毒力;细胞免疫荧光实验检测Cx43的表达和分布;荧光法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot检测Cx43、pAMPK、AMPK和GAPDH的表达。结果 Met能增加H9c2细胞活力,降低细胞内ROS水平,对LDH释放差异无显著性;Met使AMPK磷酸化水平明显升高,增加心肌Cx43表达,改善Cx43的分布。结论 Met可能通过激活AMPK途径,增加心肌细胞Cx43的表达和减少细胞内ROS的产生,进而发挥心血管的保护效应。     

左归丸对化疗性卵巢早衰小鼠卵巢组织中缝隙连接蛋白43表达的影响

目的:研究左归丸对环磷酰胺(CTX)致卵巢早衰(POF)小鼠卵巢组织中缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探讨左归丸治疗化疗性POF的作用机制。方法:将72只小鼠按体质量随机分为空白组、模型组、戊酸雌二醇片组(阳性对照,0.000 13 g/kg)和左归丸低、中、高剂量组(13.65、40.95、122.85 g/kg),每组10只。除空白组外,其余各组小鼠均ip CTX复制POF模型,每天1次,连续20 d;并同时ig相应药物,每天1次,连续30 d。末次给药2h后,分别采用反转录-聚合酶链反应法和Western blot法检测卵巢组织中Cx43 mRNA和蛋白表达;并采用免疫组化法检测卵巢组织中Cx43蛋白的分布。结果:与空白组比较,模型组大鼠卵巢组织中Cx43 mRNA及蛋白表达均明显减弱,卵泡与颗粒细胞中Cx43蛋白的分布明显减少(P<0.01);与模型组比较,戊酸雌二醇片组和左归丸中、高剂量组小鼠卵巢组织中Cx43 mRNA及蛋白表达均明显增强,卵泡与颗粒细胞中Cx43蛋白的分布明显增加(P<0.01)。结论:左归丸可上调CTX致POF小鼠卵巢组织中Cx43 mRNA及蛋白表达,增加Cx43在卵泡及颗粒细胞间的分布,改善缝隙连接功能,这可能是其治疗POF的作用机制之一。     

阿片受体激动剂U50,488H通过Cx43介导的抗心律失常作用与抑制钙通道有关

目的研究U50,488H(选择性κ阿片受体激动剂)是否通过抑制钙通道减少外钙内流参与了κ阿片受体的抗缺血性心律失常作用。方法将30只SD大鼠完全随机设计分为5组(每组6只):对照组(Sham)、缺血组(Isc)、缺血+U50,488H组(Isc+U50)、缺血+U50,488H+钙离子通道激动剂Bay k8644组(Isc+U50+Bay)、缺血+Bay k8644组(Isc+Bay)。建立大鼠急性心肌缺血模型,施行30 min心肌缺血前应用U50,488H(1.5 mg.kg-1)及Bay k8644(66.7μg.kg-1)进行干预,观察各组心律失常发生情况及连接蛋白43(Cx43)在蛋白和基因水平表达的变化。结果①在体动物模型中,Bay k8644可以翻转U50,488H激活κ阿片受体后产生的抗心律失常作用(P<0.05)。②在蛋白表达水平,Bay k8644可以阻断U50,488H对缺血心肌Cx43的保护性上调作用(P<0.01)。③在mRNA表达水平,Bay k8644亦可翻转U50,488H激活κ阿片受体后对缺血心肌Cx43mRNA的调控作用(P<0.01)。结论 U50,488H可通过抑制钙通道减少外钙内流,参与κ阿片受体对缺血心肌Cx43的稳定性调控及抗缺血性心律失常作用。     

线粒体Cx43参与Heptanol保护兔心肌缺血/再灌注损伤

目的探讨线粒体Cx43和线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKA+TP)在Heptanol保护兔心肌缺血/再灌注损伤的作用。方法兔80只,建立心肌缺血/再灌注模型,随机分5组,每组16只:假手术组(sham组)、缺血/再灌注组(IR组)、缺血预处理组(IP组)、Heptanol预处理(HT组)和5-羟葵酸加heptanol预处理组(HT+5-HD组)。测定血浆磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB),肌钙蛋白(cTnI)含量以及心肌梗死面积,采用电子显微镜(电镜)观测心肌线粒体结构变化,应用Westernblot检测线粒体Cx43蛋白含量。结果再灌注4h末血浆CK-MB与cTnI活性及心肌梗死面积,IP组和HT组明显低于IR组和HT+5-HD组(P<0.01)。电镜检测线粒体发现,与sham组比较,其他各组均损伤明显(P<0.01);与IR组比较,HT组、IP组(P<0.01)和HT+5-HD组(P<0.05)明显减轻;与HT+5-HD组比较,HT组和IP组损伤明显减轻(P<0.01)。Western blot检测线粒体Cx43蛋白发现,与sham组比较,HT+5-HD组和IR组线粒体Cx43蛋白明显下降(P<0.01);与IR组比较,HT组、IP组(P<0.01)和HT+5-HD组(P<0.05)心肌线粒体Cx43明显升高;与HT+5-HD组比较,HT组和IP组心肌线粒体Cx43升高(P<0.01)。结论线粒体Cx43可能参与Hep-tanol预处理的心肌保护作用,其机制可能与mitoKA+TP有关。     

bFGF和IGF-1对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化促进作用及相关机制探讨

目的 探讨成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)单独或联合使用对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)向心肌细胞(cardiomyocytes, CMs)分化的影响,以及IGF-1和bFGF促分化的作用机制。方法 IGF-1和bFGF单独或联合使用,以及IGF-1和bFGF分别与LY294002联用,诱导4周后,采用免疫细胞化学、免疫荧光检测心肌特异性蛋白表达水平;Western blot检测心肌特异性蛋白和通路相关蛋白表达水平;透射电镜观察细胞的超微结构。诱导1、2和4周后,采用RT-qPCR检测心肌转录因子表达水平。结果 IGF-1和bFGF单独或联合组,均提高心肌特异性蛋白和基因表达水平,且最高表达水平出现在IGF-1和bFGF联合组。IGF-1和bFGF联用组,透射电镜可观察到平行排列的肌丝,以及线粒体和内质网等丰富细胞器。IGF-1和bFGF分别与LY294002联用组,相较于I...