抗水痘-带状疱疹病毒药物的研究进展

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus,VZV)是一种α疱疹病毒。VZV的初次感染会引发水痘,之后潜伏于神经节中。VZV的再激活会导致带状疱疹和其他多种神经性疾病。目前阿昔洛韦是首选的抗水痘-带状疱疹病毒药物,近年来其它一些处于研究中的抗水痘-带状疱疹病毒药物都表现出较好的抗病毒活性。     

水痘-带状疱疹病毒疫苗

Merck公司生产的水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗Varivax历经14年的临床研究之后,终于在1995年被批准在美国使用。美国儿科学会与免疫实施咨询委员会建议将该疫苗用于12月龄至12岁的儿童、易感青少年及成年人。本文总结了VZV减毒疫苗的发展、临床研究和应用前景。     

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。     

重组人血清白蛋白-hGCSF突变体在毕赤酵母中的表达

目的通过定点突变,提高融合蛋白HSA-hGCSF的生物活性。方法结构模拟显示,对hG-CSF中5个氨基酸残基加以突变可以提高其生物活性。通过限制性酶切方法将该突变基因与HSA基因的3′连接,融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1之后,重组质粒pPIC9K-HSA-hG-CSFm经SalⅠ线性化,电击转化毕赤酵母GS115,摇瓶中进行分泌表达。用MTT比色法测定发酵液上清中融合蛋白的hG-CSF活性。结果PCR鉴定得到约为2300bp的融合基因,测序结果正确。SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白HSA-hGCSFm,表明该蛋白相对分子质量约为85000,且具有HSA的抗原性,生物活性为1.5×106IU/mL。结论分子设计实现了突变体融合蛋白生物活性的提高。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

重组人白介素-18在毕赤酵母中的表达和纯化

构建了含重组人白介素-18(rhIL-18)基因的酵母表达载体pPIC9k-il18,利用电转化法将pPIC9k-il18线性化质粒转入毕赤酵母GS115中,筛选出高表达菌株.通过离子交换亲和层析和分子筛凝胶层析两步纯化,可获得rhuIL-18试剂品HPLC纯度>97%,纯化得率49mg·L-1发酵液.IL-18具有促进KG-1细胞产生IFN-γ的活性,并且产生的IFN-γ的量与IL-18的量成剂量依赖性,测定产生IFN-γ量与商业化的rHu-IL18标准品相当.本研究为进一步规模化制备rHu-IL18奠定了基础.     

毕赤酵母表达重组hPK-5蛋白不均一性的鉴定

对毕赤酵母表达重组人纤溶酶原Kringle 5(hPK-5)蛋白的不均一性进行了鉴定.应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法及分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯度分析.采用糖蛋白染色法鉴定是否为糖蛋白.以Edman降解法测定N端氰基酸,采用高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)联用技术测定蛋白质精确分子质量.结果表明:SDS-PAGE测定为单一条带,纯度大于95%,SEC-HPLC测定为单一色谱峰,纯度大于95%,RP-HPLC测定为几个紧密相连的峰.糖蛋白染色为阴性.N端氨基酸测定结果表明含多个N端氨基酸.液质联用测定精确分子质量的结果表明hPK-5蛋白是相对分子质量分别为10 744.88,10 646.00,10 533.00和10 419.63的混合物.以上结果准确鉴定出毕赤酵母表达的该重组hPK-5蛋白是C端完整而N端依次缺失0～3个氨基酸的不均一蛋白.     

更昔洛韦与阿昔洛韦对水痘患者抗水痘-带状疱疹病毒临床疗效的Meta分析

目的:分析阿昔洛韦和更昔洛韦对水痘患者抗水痘-带状疱疹病毒的临床疗效。方法:应用计算机检索PUBMED、MEDLINE、EMBASE、CNKI、VIP和万方数据库,查找和比较阿昔洛韦、更昔洛韦治疗水痘患者的随机对照试验结果,检索时间均为建库至2017年5月31日止;手工检索、下载、阅读、评价纳入文献的参考文献;按纳入和排除标准确定是否进入研究,由2人独立进行纳入文献的筛选和质量评价,采用Rev Man 5.3版统计学软件进行Meta分析。结果:纳入13篇研究文献,共1 691例患者(更昔洛韦组920例,阿昔洛韦组771例),结果显示治疗水痘患者的总有效率(Ζ=5.47,P<0.01)以及疼痛消失时间(Ζ=11.85,P<0.01)、体温复常时间(Ζ=3.35,P<0.01)和结痂时间(Ζ=5.23,P<0.01)方面,经两组间比较其差异均有统计学意义;不良反应方面仅有3篇研究文献有比较,所有不良反应均较为轻微,经两组间比较其差异均无统计学意义(Ζ=1.24,P>0.05)。结论:更昔洛韦和阿昔洛韦均有显著的抗水痘病毒作用,更昔洛韦在有效率、疼痛缓解时间、体温复常时间、结痂时间等方面均更有优势;二者不良反应均较为轻微,相互比较无差异。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

Chemotherapy of varicella zoster virus infections

Varicella zoster virus (VZV), a member of the herpesvirus family, is responsible for a primary infection (varicella, chickenpox) as well as a recurrent disease (zoster, shingles). The course of varicella is generally benign in immunocompetent patients. For zoster, post-herpetic neuralgia is the most common complication. In immunocompromised patients, particularly patients suffering from the acquired immune deficiency syndrome (AIDS), transplant recipients and cancer patients, VZV infections can be life-threatening. For these patients and also for immunocompetent patients at risk, such as pregnant women or premature infants, the current treatment of choice is based on acyclovir (ACV) by either intravenous or oral route. The low oral bioavailability of ACV, as well as the emergence of drug-resistant virus strains, have stimulated efforts towards the development of new compounds for the treatment of VZV infections. Among these new compounds, penciclovir (PCV) and its oral prodrug form, famciclovir (FCV), 882C87, BVDU, BVaraU and the oral prodrug form of acyclovir (valacyclovir) rank among the most promising. Like ACV itself, all these drugs are dependent on the virus-encoded thymidine kinase (TK) for their intracellular activation (phosphorylation), and, therefore, cross-resistance to these drugs may be expected for those virus mutants that are TK-deficient and thus resistant to ACV. However, such TK(-) VZV mutants are still sensitive to the acyclic nucleoside phosphonates (i.e. HPMPC), which for their phosphorylation do not depend on the virus-encoded TK. The molecular targets within the viral replicative cycle, with which these different compounds interact, are discussed, as are the in vitro activity and in vivo efficacy of the most promising compounds. Other aspects, such as vaccination and passive immunization, are briefly mentioned.     

重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

Expression and processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia pastoris.

Sarafotoxins are peptides isolated from the Atractaspis snake venom, with strong constrictor effect on cardiac and smooth muscle. They are structurally and functionally related to endothelins. The sarafotoxins precursor cDNA predicts an unusual structure 'rosary-type', with 12 successive similar stretches of sarafotoxin (SRTX) and spacer. In the present work, the recombinant precursor of SRTXs was sub-cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris, and secreted to the culture medium. Characterization by SDS-PAGE, immunoblot, mass spectrometry and biological activity, suggests that intact precursor was expressed but processing into mature toxins also occurred. Furthermore, our results indicate that the correct proportion of sarafotoxin types as contained in the precursor, is obtained in the yeast culture medium. Contractile effects of the expressed toxins, on rat and Bothrops jararaca isolated aorta, were equivalent to 5x10(-10)M and 5x10(-11)M of sarafotoxin b, respectively. The enzymes responsible for the complete maturation of sarafotoxins precursor are still unknown. Our results strongly suggest that the yeast Pichia pastoris is able to perform such a maturation process. Thus, the yeast Pichia pastoris may offer an alternative to snake venom gland to tentatively identify the molecular process responsible for SRTXs release.     

重组HPV病毒样颗粒二级结构的圆二色谱法预测

目的 分析重组HPV病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）的二级结构。方法 取重组HPV16、18、52、58型VLP各1批,均调整蛋白浓度至250〜500 μg/ml,采用圆二色谱远紫外扫描,预测重组HPV VLP的二级结构。结果 重组HPV16 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%,反平行β折叠37.1%,平行β折叠4.5%,β转角19.2%,不规则卷曲30.3%;重组HPV18 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.9%,反平行β折叠36.9%,平行β折叠4.6%,β转角19.0%,不规则卷曲30.7%;重组HPV52 VLP二级结构的预测结果为α螺旋12.3%,反平行β折叠37.1%,平行β折叠4.7%,β转角19.0%,不规则卷曲30.2%;重组HPV58 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%,反平行β折叠35.3%,平行β折叠4.4%,β转角20.4%,不规则卷曲31.3%。结论 圆二色谱法预测了重组HPV16/18/52/58型VLP的二级结构,该技术可用于重组HPV VLP的结构确证研究。     

戊型肝炎病毒及其病毒样颗粒疫苗的研究进展

戊型肝炎(hepatitis E,HE)是全球最主要的病毒性肝炎之一,由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染导致.因为HEV不能在体外细胞培养体系中有效生长,因此HE灭活或减毒活疫苗的研制不可行.目前HE疫苗研究主要集中在有免疫原性的重组病毒衣壳蛋白上.HEV的开放读码框架2编码的蛋白为病毒衣壳蛋白,可在体外自行组装成病毒样颗粒(virus-like particle,VLP).形成的VLP在动物和人体中均可诱导产生高滴度的保护性抗体,是理想的预防性疫苗组分.此文就HEV的流行病学、HEV VLP的形成机制和结构特征以及VLP疫苗的研究现状作一综述.     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin,并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA,将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

Disassembly and reassembly of yeast-derived recombinant human papillomavirus virus-like particles (HPV VLPs)

The human papillomavirus (HPV) virus-like particles (VLPs) produced by recombinant expression systems are promising candidate vaccine antigens for prevention of cervical cancers as well as genital warts. However, expression of HPV type 6, 11, and 16 L1 proteins in Saccharomyces cerevisiae yielded irregularly shaped, broadly distributed VLPs smaller in size (30-50 nm) than expected (60 nm). In this study, we demonstrate that these HPV VLPs can be disassembled into the constituent capsomers (L1 pentamers) by incubation at low ionic strength and elevated pH in the presence of relatively low concentration of reducing agents. Following the removal of reducing agents, lowering of pH and increasing of ionic strength, the capsomers spontaneously reassembled into homogenous, 60-nm VLPs characterized by significantly enhanced structural stability and improved immunogenicity. In order to achieve quantitative recovery of HPV VLPs, the disassembly/reassembly process was further optimized by use of high ionic strength (>0.5 M sodium chloride) to prevent aggregation of VLPs. The reassembled VLPs possess an architectural structure very similar to that of the natural HPV virus particles. This development illustrates how the natural, in vivo mechanisms facilitating cell entry and virus replication can be utilized to achieve an optimal, in vitro assembly state of yeast-expressed HPV VLPs.     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 表达重组脂联素融合蛋白(adiponectin-Trx),并测定其生物学活性.方法 从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实.将目的 序列(18-247氨基酸)亚克隆至pET-32(a)表达载体,重组质粒adiponectin/pET32(a)的序列经测序证实.将adiponectin/pET32(a)转化表达宿主菌OrigamiTM(DE3),在27℃以1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达目的 蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的 蛋白经组氨酸镍螫和树脂亲和纯化.以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性.结果 小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被C置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代.序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达.表达产物的相对分子量(Mr)同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43 000,Trx Mr为19 000.在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖.结论 小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同.成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性.     

检测抗水痘-带状疱疹病毒抗体的糖蛋白ELISA的建立和初步验证

目的 建立抗水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)抗体的VZV糖蛋白(glycoprotein,gp) ELISA(VZVgp ELISA),提高抗VZV抗体的检测灵敏度.方法 将收获的VZV进行超声破碎和亲和层析,得到纯化的VZVgp.以VZVgp作为包被抗原,用筛选的高滴度抗VZV抗体阳性血清摸索ELISA的相关条件来建立VZVgp ELISA,并验证该法的特异性、精密度和灵敏度.同时将建立的VZVgp ELISA与同类进口试剂盒进行比较.结果 成功建立了检测抗VZV抗体的VZVgp ELISA,该法特异性强、精密度好(变异系数＜10％)、灵敏度高,与国外同类试剂盒检测结果间的差异无统计学意义(x2=1.310,P=0.252).结论 建立的VZVgp ELISA特异、灵敏,可用于人群血清抗VZV抗体的筛查和VZV感染的流行病学调查.