彝药益元化腐汤浸膏对溃疡性结肠炎模型T细胞亚群干预机制研究*

目的研究彝药益元化腐汤调控T细胞亚群介导治疗溃疡性结肠炎的效应机制，为益元化腐汤临床应用治疗溃疡性结肠炎提供科学基础。方法 32只C57BL/6健康雌性小鼠随机分为正常组、模型组、益元化腐汤中剂量（4.05 g·kg-1）和高剂量组（8.1 g·kg-1），每组8只。除正常组，其余以自由饮水的方式给予3%葡聚糖硫酸钠（sodium dextran sulfate，DSS）诱导建立溃疡性结肠炎小鼠模型，每2 d更换1次饮用水，自饮用DSS第1天起，各组按相应剂量灌胃给药，每日1次，连续8 d；采用疾病活动指数（diseases activity index，DAI）和苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）分别评价溃疡性结肠炎症状及结肠组织形态学变化；荧光定量PCR（qPCR）检测淋巴细胞T细胞亚群相关因子转录的相对表达水平；流式细胞术（flow cytometry）检测T细胞亚群中辅助性T细胞1（T-helper 1 cell, Th1）、辅助性T细胞17（T-helper 17 cell，Th17）和调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的表达水平。结果 与正常组比较，病理模型组小鼠体质量和结肠质量显著下降、结肠长度显著缩短（P<0.05或P<0.01）；与病理模型组比较，益元化腐汤组显著增加小鼠体质量、结肠质量及其长度（P<0.05或P<0.01），改善结肠病理损伤程度；流式细胞术检测结果显示，益元化腐汤药物干预显著下调γδTCR表达（P<0.05），且抑制Th1细胞（CD4+ IFN-γ+ T细胞）、Th17细胞（CD4+ IL-17+ T细胞）绝对数量和比例（P<0.01），然而对Treg细胞（CD4+ Foxp3+ 调节性T细胞）表达无明显影响。qPCR检测结果显示，益元化腐汤显著下调UC小鼠Th17细胞因子IL-17A和转录因子RORγτ mRNA表达（P<0.01）。结论 彝药益元化腐汤可能通过抑制Th17细胞诱导的炎症反应介导治疗溃疡性结肠炎。     

海南萝芙木提取物对DSS小鼠结肠炎MAPK信号通路的影响

目的:探讨海南萝芙木(Rauvolfia verticillata(Lour.)Baill.var.hainanensis Tsiang)提取物果胶多糖(pectic polysaccharides,PP)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulphatesodium,DSS)小鼠结肠炎的作用及机制。方法:80只BALB/C小鼠随机分为4组:(1)正常对照组;(2)DSS组;(3)DSS+柳氮磺胺吡啶(SASP)治疗组;(4)DSS+PP治疗组。实验结束后,观察各组小鼠每日一般情况。剖取各组小鼠结肠炎症组织,免疫组织化学检测法检测各组小鼠结肠黏膜组织中丝裂原活化蛋白激酶信号通路的关键酶细胞外调节蛋白激酶(ERK)、P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和c-Jun基末端激酶(JNK)蛋白表达情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测定小鼠结肠组织肿瘤坏死因子α(TNF-ɑ)、白介素-6(IL-6)细胞因子表达情况。结果:SASP治疗组和PP治疗组小鼠一般情况优于DSS组;与DSS组相比,ERK、p38 MAPK和JNK蛋白表达明显下调;SASP治疗组和PP治疗组结肠组织中TNF-α、IL-6水平均显著降低。结论:提示海南萝芙木提取物果胶多糖对DSS小鼠结肠炎有显著治疗作用,其可能是通过干预MAPK信号通路发挥此作用。     

葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠中TRAIL-R基因敲除对Th17细胞凋亡的影响

目的：采用葡聚糖硫酸钠（DSS）构建实验性结肠炎小鼠模型,探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的受体基因敲除（TRAIL -R -/-）对结肠炎症及Th17细胞凋亡的影响。方法：将C57BL/6品系小鼠分为4组：TRAIL -R -/-结肠炎组、TRAIL -R -/-对照组、野生型（WT）结肠炎组、WT对照组,每组各9只。结肠炎组饮用3.5%的DSS,对照组饮用清水。7 d后,从临床表现和组织病理学上评估小鼠结肠炎的严重程度。取外周血单个核细胞（PBMCs）和结肠黏膜固有层单个核细胞（LPMCs）,采用流式细胞术检测Th17细胞占CD4+T细胞的比例,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测视黄酸相关孤儿受体（ROR-γt）和IL-17A的mRNA和蛋白表达水平。采用TUNEL荧光染色技术及激光共聚焦显微镜观察结肠组织中Th17细胞的凋亡率。通过比色法检测结肠组织中凋亡蛋白酶Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活性。结果：DSS诱导后,TRAIL -R -/-小鼠较WT小鼠发生了更为严重的结肠炎。TRAIL -R -/-结肠炎小鼠PBMCs中Th17 细胞的比例（P ＜0.01）,以及ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表达水平均显著高于WT结肠炎小鼠（均P ＜0.05）。TRAIL -R -/-结肠炎小鼠LPMCs中Th17细胞的比例（P ＜0.01）,以及ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表达水平均显著高于WT结肠炎小鼠（均P ＜0.05）。与WT结肠炎小鼠相比,TRAIL -R -/-结肠炎小鼠的结肠组织中Th17细胞的凋亡率（P ＜0.01）以及Caspase 3和Caspase 8的酶活性均显著降低（均P ＜0.01）。结论：DSS诱导后,TRAIL -R -/-小鼠的结肠炎症较WT小鼠更为严重,原因可能是Th17细胞凋亡减少,其数目和活性增高所致。     

奇任醇通过抑制炎症细胞因子和诱导淋巴细胞凋亡减轻小鼠溃疡性结肠炎

目的 研究奇任醇在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）发生和发展中的作用。方法 将C57BL/6小鼠随 机分为UC+双蒸水灌胃组和UC+奇任醇治疗组。所有小鼠连续7 d在饮水中加入DSS建立UC模型,第0天到第7天双蒸水或 奇任醇灌胃给药。每日观察小鼠体质量、直肠出血和粪便性状等临床指标并进行疾病活动度指数评分（DAI）。7 d后处死小鼠, 观察结肠组织形态和长度,行组织病理学分析。取肠系膜淋巴结制成单细胞悬液并体外用抗CD3和抗CD28刺激活化,分析细 胞培养上清中分泌的细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-6 和TNF-α的含量,流式细胞术检测肠系膜淋巴结细胞的凋亡百分比。结果 奇任醇可以抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎的发生发展,减轻结肠损伤,抑制炎症细胞因子的分泌,诱导淋巴细胞的凋亡。结论 奇任醇可以缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎,这种作用可能与抑制炎症细胞因子分泌和诱导炎性淋巴细胞凋亡有关。     

栀子苷对Treg细胞分化和功能的影响及其机制研究

目的 考察栀子苷对初始T细胞（Nave T）向Treg定向分化的影响和机制。方法 通过磁珠分选小鼠脾脏CD4+CD62L+T,诱导其向Treg分化,单独使用栀子苷以及与ERK通路阻断剂、JNK阻断剂合用,流式细胞术检测Treg细胞比例,Western blot法检测转录因子Foxp3、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK等表达,ELISA法检测细胞上清IL-10含量。结果 与Control组比较,栀子苷组Treg细胞比例,Foxp3、p-ERK、p-JNK表达,IL-10含量显著增高（P<0.05~0.01）;单纯诱导的基础上先加入ERK通路阻断剂再加入栀子苷,其Treg细胞比例、Foxp3表达水平、IL-10含量显著低于栀子苷组（P<0.05~0.01）,但高于Control组（P<0.01）;单纯诱导的基础上先加入JNK阻断剂再加入栀子苷,其Treg细胞比例、Foxp3表达水平、IL-10含量显著低于栀子苷组（P<0.05~0.01）,但高于Control组（P<0.01）。结论 栀子苷可以显著促进Nave T向Treg定向分化,同时增强其功能,ERK、JNK可能和其发挥作用有一定关系。      

抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对小鼠溃疡性结肠炎外周血和肠系膜淋巴结CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞表达的影响

目的 观察抗小鼠Toll样受体2(Toll-like receptor 2)胞外段(mTLR2ECD)单表位抗体TSP-2对溃疡性结肠炎小鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞表达的影响.方法 采用硫酸葡聚糖钠(C6H7Na3O14S3,DSS)制备溃疡性结肠炎小鼠模型(UC模型),将实验小鼠随机分成四组:正常对照(NC)组、模型(MD)组、TSP-2治疗组和兔IgG治疗组.除NC组外,其他实验组均给予5％ DSS造模7d后停用造模药,药物治疗组给予后续干预治疗7d.记录分析疾病活动指数(DAI),14 d后处死小鼠,取结肠组织行HE染色;流式细胞仪检测外周血和肠系膜淋巴细胞中表达CD4+ CD25+Foxp3+的Treg细胞的百分比率,并进行统计学分析.结果 TSP-2治疗组小鼠第9～14天DAI明显低于MD组(P＜0.05);MD组外周血和肠系膜淋巴细胞CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞占CD4+T细胞的百分率明显低于NC组(P＜0.05); TSP-2治疗组外周血和肠系膜淋巴细胞CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg 细胞占CD4+T细胞的百分率明显高于MD组(P＜0.05);兔IgG治疗组与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TSP-2可以提高CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg数量,调节机体和肠道免疫功能,对UC发挥治疗作用.     

GC-C-/-小鼠在DSS诱导下肠道炎症损伤的变化

  目的  了解鸟苷酸环化酶C（GC-C）信号通路在右旋糖酐硫酸酯钠（DSS）诱导小鼠肠道炎症性损伤发生中的作用。  方法  运用DSS构建GC-C基因敲除（GC-C-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠结肠炎模型,将小鼠分为炎症组和对照组,前者给予3%的DSS溶液自由饮用1周,后者给予正常饮食。运用qRT-PCR和Westernblot方法检测结肠组织GC-C mRNA和蛋白的表达,在光学显微镜下观察经HE染色后结肠组织的炎症损伤情况并进行组织病理学评分。运用ELISA方法检测小鼠外周血与肠黏液中炎症因子（IL-8和TNF-α）的水平。  结果  （1）与WT小鼠相比,GC-C-/-小鼠在DSS作用下疾病活动指数（DAI）评分明显升高（P < 0.05）, 结肠缩短、肠管增粗、充血水肿更明显;（2）显微镜下观察到GC-C-/-+DSS组小鼠结肠组织炎症损伤更为严重,组织病理学评分较WT+DSS组小鼠明显升高（P < 0.05）;（3）GC-C-/-小鼠在DSS诱导下外周血和肠粘液中IL-8和TNF-α水平较WT+DSS组明显升高（P < 0.05）。  结论  GC-C-/-小鼠在化学物质诱导下肠道炎症性损伤加重,GC-C信号通路可能参与了溃疡性结肠炎（UC）的发生与发展。     

高脂饮食下核因子κB调控自噬在小鼠溃疡性结肠炎中的作用及其机制

目的 观察核因子κB (NF-κB)调控自噬在高脂饮食下葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎中的作用及其机制。方法 将小鼠分为正常对照组（Control组）、高脂饮食组（HFD组）、DSS组、DSS+高脂饮食组（DSS+HFD组）,每组12只。采用体质量差值、疾病活动指数（DAI）和结肠组织病理学结果评估小鼠一般情况和结肠组织炎症程度,采用ELISA检测小鼠血清炎性细胞因子水平,采用实时PCR检测小鼠结肠组织中NF-κB和LC3 mRNA的表达情况。结果 DSS+HFD组体质量差值小于Control组和DSS组（均P <0.05）。DSS+HFD组DAI、结肠组织病理学评分大于Control组和DSS组（均P <0.05）。DSS+HFD组血清白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)以及结肠组织NF-κB mRNA水平高于Control组和DSS组（均P <0.05）。DSS+HFD组结肠组织LC3 mRNA水平低于Control组和DSS组（均P <0.05）。DSS+HFD组血清IL-10水平低于Control组（P <0.05...     

实验性血小板微粒对葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响

目的 探讨血小板微粒(PMPs)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠肠道炎症程度及肠黏膜通透性的影响。方法 实验分为正常对照组(n=10,饮用无菌蒸馏水+腹腔注射0.9%氯化钠溶液)、PMPs组(n=10,饮用无菌蒸馏水+腹腔注射PMPs)、DSS模型组(n=10,饮用DSS溶液+腹腔注射0.9%氯化钠溶液)、实验组(n=15,饮用DSS溶液+腹腔注射PMPs)。收集炎症性肠病(IBD)患者外周血制备PMPs悬液。小鼠自由饮用5%DSS溶液1周构建结肠炎模型，连续7 d腹腔注射PMPs,每天记录疾病活动指数(DAI)评分，实验结束后取结肠标本，HE染色计算小鼠病理组织学评分(HI)评估肠道炎症的严重程度，结肠匀浆检测髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组蛋白H3(citH3)及游离DNA水平，透射电镜观察肠黏膜结构，采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-D)法检测肠黏膜通透性。结果 与正常对照组相比，PMPs组小鼠结肠黏膜水肿、上皮结构破坏严重、炎细胞广泛聚集，总体HI升高(P<0.01);PMPs组小鼠结肠组织匀浆IL-1β、TNF-α等炎症因子水平升高(...     

双歧三联活菌胶囊治疗溃疡性结肠炎的疗效及对CD4+CD25+调节性T细胞和IL-10的影响

目的 研究双歧三联活菌胶囊辅助治疗溃疡性结肠炎的疗效及对CD4+CD25+调节性T细胞和白细胞介素-10(IL-10)的影响.方法 将112例轻、中度溃疡性结肠炎患者分为观察组和对照组,每组56例.对照组采用常规治疗,观察组在常规治疗基础上加用双歧三联活菌胶囊.疗程6个月.比较两组治疗前后临床症状评分、结肠炎症评分、外周血CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+ T细胞百分比及IL-10水平的差异.结果 治疗前后两组临床症状及结肠黏膜炎症均较治疗前有明显改善(P<0.05),且观察组改善程度优于对照组(P<0.05).治疗后观察组外周血CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+ T细胞百分比、IL-10水平较治疗前升高(P<0.05),且高于对照组治疗后(P<0.05).结论 双歧三联活菌胶囊可辅助治疗溃疡性结肠炎,CD4+CD25+调节性T细胞和IL-10可能参与了溃疡性结肠炎的发生发展.     

抗CXCL1中和抗体在急性溃疡性结肠炎小鼠模型中的治疗作用

目的：探讨抗CXC趋化因子配体1(CXCL1)中和抗体对葡聚糖硫酸钠(dextra sulfate sodium,DSS)诱导的 急性溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠模型的治疗作用,并阐明其对结肠组织中细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL- 17,IL-10的表达及中性粒细胞浸润的影响。方法：雌性BALB/c小鼠48只,随机分为正常对照组(DSS-)、疾病组 (DSS+saline)、抗CXCL1中和抗体治疗组(DSS+anti-CXCL1 Ab)和治疗对照组(DSS+IgG Ab),每组12只。正常对照组小 鼠给予蒸馏水自由饮用,疾病组、治疗组及治疗对照组给予3.5%的DSS自由饮用,至第8天处理小鼠。其中治疗组于 造模第3天和第6天腹腔注射抗CXCL1中和抗体(4 mg/kg),治疗对照组予以等量大鼠IgG抗体,正常对照组和疾病组 注射等量生理盐水。对各组小鼠进行疾病活动指数评分(disease activity index,DAI)及结直肠组织损伤学评分,并采用 RT-PCR法检测各组小鼠结肠组织中细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-17和IL-10的表达。运用免疫组织化学检测各组小鼠 结肠组织中中性粒细胞特异性标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的表达。结果：与正常对照组相比,疾病 组小鼠DAI评分及结直肠组织损伤学评分明显增高,但是予以抗CXCL1中和抗体干预治疗后能明显减低急性UC小鼠 的DAI和结直肠组织损伤学评分。RT-PCR检测结果显示：与正常对照组相比,疾病组小鼠结直肠组织中促炎细胞因 子TNF-α,IFN-γ和IL-17 mRNA表达水平均显著升高,抑炎因子IL-10 mRNA表达下降。而使用抗CXCL1中和抗体干预 治疗,明显抑制DSS诱导的小鼠结肠组织中促炎细胞因子TNF-α,IFN-γ和IL-17 mRNA表达水平的升高及抑炎因子IL- 10 mRNA表达水平的下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示：疾病组小鼠结肠组织中中性粒 细胞的浸润明显增加,予以抗CXCL1中和抗体治疗能显著减少结肠组织中中性粒细胞的浸润,差异具有统计学意义 (P<0.05)。结论：抗CXCL1中和抗体缓解了DSS诱导的急性UC的进展,其发挥抗炎作用的机制可能与抑制促炎因子的 表达和中性粒细胞的浸润有关。     

旋毛虫对三硝基苯磺酸诱导肠炎小鼠Th1/Th2类细胞因子基因表达的影响

目的：研究旋毛虫对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的实验性小鼠肠炎模型Th1/Th2类细胞因子基因表达的影响。方法：雌性BALB/c小鼠随机分为50%乙醇对照组、旋毛虫（T. spiralis）应用组、 TNBS诱导肠炎模型组、预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组，（每组小鼠取材时保证6只以上）。采用RT-PCR方法观察感染旋毛虫和未感染旋毛虫小鼠于TNBS诱导肠炎后3 d和7 d时不同基因的表达变化，包括小鼠脾脏中IFN-γ、IL-4、IL-10 mRNA和结肠中IL-10 mRNA的表达量。结果：预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组小鼠在造模后3 d脾脏中IFN-γ mRNA的表达量与模型组比较差异无显著性(P>0.05)，在造模后7 d脾脏中IFN-γ mRNA的表达量低于模型组（P<0.05）， IL-4 mRNA的表达量于3 d和7 d时均高于模型组（P<0.05）。预先感染T. spiralis后诱导TNBS模型组小鼠在造模后3 d和7 d脾脏和结肠中IL-10 mRNA的表达量均高于模型组（P<0.05）。结论：旋毛虫对TNBS诱导的实验性小鼠肠炎外周免疫作用机制可能通过下调炎症性肠病过度的Th1型免疫反应、上调Th2型免疫反应而实现；IL-10既作为Th2类细胞因子又作为Tr1型细胞因子对实验性小鼠的肠道局部和外周免疫均产生重要调节作用。     

双歧三联活菌胶囊治疗溃疡性结肠炎的疗效及其对CD4+CD25+调节性T细胞和IL-10的影响

目的 探讨双歧三联活菌胶囊辅助治疗溃疡性结肠炎(UC)的临床疗效及其对CD4+CD25+调节性T细胞和IL-10的影响.方法 选取溃疡性结肠炎患者87例,采用随机数表法分为观察组45例和对照组42例.对照组给予抗生素及5-氨基水杨酸制剂奥沙拉嗪钠胶囊进行常规对症治疗,观察组在常规对症治疗基础上加用双歧三联活菌胶囊治疗.比较两组患者治疗前后的结肠炎症评分、CD4+CD25+调节性T细胞和IL-10变化及临床疗效.结果 治疗后观察组的总有效率为86.67%,明显高于对照组的69.05%,差异有统计学意义(P<0.05);治疗前两组结肠症状评分比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后观察组结肠症状评分明显低于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01);治疗前两组CD4+CD25+调节T细胞占CD4+T细胞比例及IL-10水平值比较差异均无统计学意义(P>0.05),治疗后观察组CD4+CD25+调节T细胞占CD4+T细胞比例及IL-10水平均明显高于对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01).结论 歧乳杆菌三联活菌胶囊辅助治疗UC患者疗效确切,且CD4+CD25+调节性T细胞比例及IL-10水平均有明显升高,在改善患者肠道内微生物平衡中具有显著作用,值得推广应用.     

清肠化湿方对溃疡性结肠炎小鼠炎症及肠道菌群的影响

目的 探究清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用及机制.方法 DSS诱导制备溃疡性结肠炎小鼠模型,称小鼠体质量,量取结肠长度,制备结肠病理切片,ELISA法检测结肠组织中IL-6和TNF-α的水平,气相色谱-质谱法分析测定结肠肠道内容物中丁酸、异丁酸的含量,基于16 S rRNA扩增与高通量测序技术检测分析小鼠粪便...     

双氧化酶2在5-羟色胺加重的小鼠结肠炎模型中的表达及作用

目的 探讨5-羟色胺(5-HT) 对双氧化酶2 (Duox2) 在小鼠结肠组织中的表达情况及其在炎症中的意义.方法 选取6~8周龄的健康清洁级C57BL/6J(B6)雄性小鼠,随机分为5组(n=8):对照组自由饮用无菌蒸馏水;葡聚糖硫酸钠(DSS)(1.0%、2.5%)组自由饮用相应浓度的DSS溶液;5-HT组采用直肠灌药方式(1.0 mg/kg)给药,每3 d 1次;DSS+5-HT组同时给予1.0% DSS和5-HT.于造模第6天处死小鼠取结肠组织.通过结肠长度、疾病活动指数(DAI)评分和HE染色等方法评估肠道炎症程度,采用实时定量PCR(RT-PCR)检测小鼠结肠组织中白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和 Duox2 mRNA表达水平,应用免疫组化检测结肠组织中Duox2蛋白的表达情况.结果 对照组和5-HT组小鼠无肠炎表现;DSS (1.0%) 组小鼠表现为轻度肠炎;DSS+5-HT组和DSS (2.5%) 组有严重急性肠炎表现.IL-1β、IL-6和TNF-α等表达量随炎症程度加重而增加.Duox2 mRNA在5-HT组和DSS (1.0%) 组表达增高(均P<0.05),在DSS+5-HT和DSS (2.5%) 组表达下调(均P<0.05).免疫组化结果显示Duox2蛋白主要表达于小鼠结肠上皮刷状缘及上皮细胞胞质中,与mRNA表达一致.结论 5-HT可能通过影响Duox2的表达在小鼠结肠炎的发生发展中发挥作用.