Bax抑制因子1通过促进视神经萎缩蛋白1表达抑制小鼠动脉血管钙化

目的 探讨Bax抑制因子1（BI-1）和视神经萎缩蛋白1（OPA1）蛋白对血管钙化的影响。方法 ApoE-/-糖尿病小鼠高脂喂养12周后予以腹腔注射Nε（- 1-羧甲基）-L-赖氨酸16周建立血管钙化模型,实验将小鼠分为4组,6只/组：对照组（ApoE-/-小鼠普通饲料喂养）、钙化组（ApoE-/-小鼠建立钙化模型）、钙化+BI-1TG组（血管特异性过表达BI-1的ApoE-/-小鼠建立钙化模型）和钙化＋BI-1TG＋OPA1-/-组（血管特异性过表达BI-1和基因敲除OPA1的ApoE-/-小鼠建立钙化模型）。另β磷酸甘油诱导血管平滑肌细胞建立细胞钙化模型。使用von Kossa染色检测血管钙化程度,使用ELISA检测主动脉钙含量,使用免疫组织化学方法检测Runt相关转录因子2和骨形态发生蛋白2表达、使用TUNEL检测细胞凋亡率,使用Western blot检测BI-1、OPA1、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3水平的表达。结果 血管钙化后,BI-1和OPA1蛋白表达均下降（P=0.0044）,钙沉积、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增加（P=0.0041）。过表达BI-1促进OPA1蛋白表达,钙沉积、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达均减少（P=0.0006）。基因敲除OPA1蛋白后,钙沉积、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3又明显增多（P=0.0007）。结论 BI-1可能通过促进OPA1表达,减轻钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡,继而抑制血管钙化。     

双特异性磷酸酶1通过视神经萎缩蛋白1抑制血管平滑肌细胞钙化

目的 研究双特异性磷酸酶1(DUSP1)/视神经萎缩蛋白1(OPA1)信号通路对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法 采用体外血管钙化模型,β磷酸甘油和氯化钙诱导大鼠主动脉血管平滑肌细胞钙化,茜素红S染色检测细胞钙化,ELISA测定钙含量,TUNEL检测细胞凋亡,Western blot测定DUSP1、OPA1、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。采用细胞转染的方法过表达DUSP1和敲减OPA1表达,观察细胞钙化、钙含量、细胞凋亡率和Runx-2、BMP-2、Caspase-3表达水平。结果 β磷酸甘油和氯化钙诱导血管平滑肌细胞钙化模型中,DUSP1(t=11.951,P<0.001)、OPA1(t=8.487,P<0.001)蛋白表达水平均显著下降。过表达DUSP1能促进OPA1蛋白表达(t=-8.921,P<0.001),减轻血管平滑肌细胞钙化,降低细胞钙含量、细胞凋亡率以及Runx-2、BMP-2、活化的Caspase-3的表达(P均<0.001);而敲减OPA1表达能促进血管平滑肌细胞钙化,增加细胞钙含量、细胞凋亡率以及Runx-2、BMP-2、活化的Caspase-3的表达(P均<0.001)。结论 DUSP1可能通过促进OPA1蛋白表达起到抑制血管平滑肌细胞钙化的作用。     

酸性环境抑制高磷诱导大鼠VSMCs 钙化的机制研究

目的 探讨酸性环境对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响及其机制。 方法 体外分离培养大鼠VSMCs,采用免疫细胞化学法鉴定。将VSMCs 按随机数字表法分为正常对照组、 高磷＋ pH 7.4 组、高磷＋ pH 7.1 组。刺激4 d 后,采用逆转录聚合酶链反应和Western blot 检测活化T 细胞 核因子c1（NFATc1）、Runt 相关转录因子2（Runx2）基因和蛋白的表达。刺激14 d 后,对各组细胞进行 钙化染色、钙含量和碱性磷酸酶（ALP）活性测定。结果 与正常对照组比较,高磷＋ pH 7.4 组的钙含量、 ALP 活性、Runx2 和NFATc1 表达升高（P <0.05）;与高磷＋ pH 7.4 组比较,高磷＋ pH 7.1 组的钙含量、 ALP 活性、Runx2 和NFATc1 表达降低（P <0.05）。相关性分析发现,NFATc1 蛋白表达水平与ALP 活性、 Runx2 蛋白表达水平呈正相关（P <0.05）。结论 酸性环境可以抑制高磷诱导的大鼠VSMCs 钙化,其机制可 能是通过降低NFATc1 表达,抑制VSMCs 表型转化来实现的。     

高磷、高钙诱导人血管平滑肌细胞钙化的研究

目的：探讨高磷及高钙诱导血管平滑肌细胞发生钙化的分子机制。方法：以人血管平滑肌细胞（ VSMCs）为模型,采用不同钙磷浓度的培养基与细胞共培养12 d,将细胞分为正常钙、磷组（对照组）、高磷组、高钙组和高磷﹢高钙组,分别采用免疫印迹（ western-blot）技术、逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）技术检测人血管平滑肌细胞核心结合因子α1（Cbfα1）、骨钙素、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白质和mRNA的表达;高磷﹢高钙条件孵育下的细胞加入ZVAD-FMK干预后,再次采用western-blot技术检测Cbfα1、骨钙素蛋白质表达的情况。结果：试验组Cbfα1、骨钙素表达增强（ P=0.013;P=0.007）,而肌成纤维细胞的特异性标志物α-SMA表达下降（P=0.009）,对照组上述3个指标无明显变化（P=0.055、P=0.074、P=0.63）;加入ZVAD-FMK与高磷﹢高钙组细胞共培养后,Cbfα1、骨钙素蛋白质的表达受到明显抑制。结论：高磷或（和）高钙通过使血管平滑肌细胞转化为成骨样细胞而导致钙化的发生;ZVAD-FMK可以在一定程度上抑制这一病理生理进程,提示凋亡和成骨分化均参与了钙化过程。     

内质网应激参与高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的作用机制

目的 探讨内质网应激是否参与高磷诱导血管平滑肌细胞钙化及其作用机制。方法 体外培养人胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）,分为对照组、正常磷组（1.3 mmol/L磷,NP组）、高磷组（2.6 mmol/L磷,HP组）,培养10 d。茜素红染色后观察细胞钙盐沉积情况;实时定量PCR和Western blotting检测肌醇需求因子1 (IRE1)、RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PERK）、内质网应激标志蛋白C/EBP同源蛋白（CHOP）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、骨形态发生蛋白2 (BMP-2)及Runt相关转录因子2 (Runx-2)的表达;应用CHOP siRNA转染高磷培养VSMC敲低CHOP表达后,检测BMP-2及Runx-2表达;应用JNK抑制剂SP600125 (DMSO溶解),终浓度10μmol/L预处理30 min后加入高磷培养基培养10 min,茜素红染色观察钙沉积情况。结果 与对照组及NP组比较,HP组内质网应激蛋白（IRE1、PERK、JNK、CHOP）及钙化蛋白（BMP-2、Runx-2）均明显增高（均P <0.01）。敲低CHOP表达后钙化蛋白...     

糖基化终产物对人血管平滑肌细胞表达及分泌甲状旁腺激素相关肽和血管钙化的影响

目的：观察糖基化终末产物（AGEs）对人血管平滑肌细胞表达及分泌甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）功能的影响,探讨PTHrP影响血管平滑肌细胞钙化发生的相关机制。方法：不同浓度的AGE-BSA分别与人血管平滑肌细胞孵育相同时间后,检测各组细胞钙含量及碱性磷酸酶（ ALP）活性判断钙化程度;酶联免疫吸附法检测各组细胞PTHrP的分泌量;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测PTHrP、核心结合因子（ cbfα1）及骨形态发生蛋白2（ BMP-2）在各组细胞中的表达量。结果：随AGEs浓度增加,细胞中的钙含量及ALP活性增加（P＜0．05）,而细胞分泌的PTHrP量逐渐减少（P＜0．05）,且AGEs可促进cbfα1、BMP-2及PTHrP在血管平滑肌细胞的表达,这在较高浓度组较为显著（ P＜0．05）。结论：适当浓度的晚期AGEs可影响人血管平滑肌细胞PTHrP的表达水平及分泌量,促进钙含量增加,进而有助于血管钙化的发生。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞Fas、caspase-8蛋白表达的研究

目的探索同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的途径。方法组织贴块法培养血管平滑肌细胞,免疫细胞化学Envision二步法和western blot对平滑肌细胞Fas、caspase-8蛋白的表达进行观察。结果在胞膜和胞浆中可见到Fas表达的阳性产物,而caspase-8蛋白则在胞浆和胞核中见到阳性表达产物,同型半胱氨酸使血管平滑肌细胞Fas、caspase-8蛋白的表达呈浓度和时间依赖性上调（P〈0.05）。western blot方法的检测结果与上述结果相符。结论同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞凋亡受体Fas表达增加,Fas可介导凋亡启动子caspase-8表达增加,这可能是同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的途径之一。     

低强度脉冲超声抑制血管平滑肌和成纤维细胞的钙化

目的：探究低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound,LIPUS）对高钙磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（rat vascular smooth muscle cell,rVSMC）及大鼠血管成纤维细胞（rat vascular adventitial fibroblasts,rVAF）钙化是否有抑制作用。方法：提取rVSMCs及rVAF,通过钙浓度测定、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、茜素红染色等方法检测不同声强的低强度脉冲超声对钙化的作用;Western blot、real?time PCR探究低强度脉冲超声对细胞成骨分化的作用。结果：LIPUS处理显著抑制了高钙磷培养基诱导rVSMCs及rVAF的钙沉积及ALP活性的升高,同时在14 mW/cm2 声强LIPUS处理后,rVSMCs及rVAF的成骨分化标志物的表达显著降低。结论：LIPUS抑制高磷钙诱导的rVSMCs及rVAF成骨分化标志物的表达,因此LIPUS对高钙磷引起的rVSMC和rVAF钙化具有保护作用。     

槲皮素调节ROS/TLR4信号通路抑制Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化

目的观察槲皮素对氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导的血管平滑肌细胞成骨样分化和钙化的作用,并阐明其分子机 制。方法采用Ox-LDL处理人血管平滑肌细胞,茜素红染色检测细胞钙化,测定碱性磷酸酶（ALP）活性和qPCR测骨相关蛋白 Msx2、BMP2、Osterix 以及收缩蛋白SMA和SM22α mRNA表达水平。观察槲皮素对Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化, ALP活性,TLR4、Msx2、BMP2、Osterix、SMA和SM22α的mRNA表达水平,ROS含量及SOD活性的影响。采用TLR4 siRNA 转染血管平滑肌细胞,观察敲低TLR4对细胞钙化,ALP活性及Msx2、BMP2、Osterix、SMA和SM22α mRNA表达水平的影响。 结果Ox-LDL可促进血管平滑肌细胞钙化和上调TLR4表达水平（P<0.05）;槲皮素能明显减轻Ox-LDL诱导的细胞钙化和降低 ALP的活性,下调Msx2、BMP2、Osterix mRNA的表达水平,上调血管平滑肌收缩蛋白SMA 和SM22α mRNA的表达水平（P< 0.05）。此外,槲皮素可明显提高SOD的活性,降低活性氧物质（ROS）的含量,下调TLR4的表达水平（P<0.05）;TLR4 siRNA也 能减轻Ox-LDL诱导的细胞钙化（P<0.05）。结论槲皮素可明显抑制Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞钙化,其机制可能与ROS 激活的TLR4信号通路有关。     

高糖激活WNT信号通路促进血管平滑肌细胞钙化

目的探讨高糖导致血管钙化机制是否与WNT信号通路有关。方法采用体外血管钙化模型,高糖诱导血管平滑肌细胞
钙化,检测WNT信号分子和骨相关蛋白Cbfa1,Osx,OCN,BMP2的表达以及细胞钙化程度。观察WNT信号抑制剂Dkk1对高
糖诱导的血管平滑肌细胞钙化和Cbfa1,Osx,OCN,BMP2表达的影响。结果高糖能上调血管平滑肌细胞WNT信号通路分子
包括Wnt3a,Wnt7a,Fzd4,Wisp1 mRNA的表达（1.86±0.15, 1.68±0.13, 2.10±0.17, 2.30±0.20, P<0.05）,促进WNT信号通路关键
分子β-catenin的磷酸化（2.70±0.22, P<0.05）,激活WNT信号通路。使用WNT信号抑制剂Dkk1能减轻血管平滑肌细胞钙化,
下调骨相关蛋白Cbfa1,Osx,OCN,BMP2 mRNA的表达［（51±9）%,（58±11）%,（56±10）%,（62±10）%,P<0.01）］。结论WNT
信号通路参与了高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化。
     

C-型利钠利尿多肽对平滑肌细胞钙化的影响

目的 :在大鼠血管平滑肌细胞上观察C -型利钠利尿多肽 (C -typenatriureticpeptide ,CNP)对钙化的影响 ,探讨CNP对血管钙化的作用机制。方法 :β -磷酸甘油诱导培养的大鼠VSMCs钙化 ;通过VonKossa染色 ,细胞钙含量 ,45 Ca2 + 聚集 ,碱性磷酸酶活性测定 ,判断钙化程度 ,放射免疫分析方法测定VSMCs培养液中cAMP和cGMP含量。结果 :①β -磷酸甘油刺激平滑肌细胞生长、增殖和钙化 (P <0 .0 1) ;②CNP可降低钙化的VSMC的钙含量、4 5 Ca2 + 聚集、碱性磷酸酶活性 (P <0 .0 1) ;③CNP可以上调培养液中cGMP含量 ;④PKG抑制剂 -H8明显抑制CNP的效应。结论 :CNP主要是通过cGMP/PKG途径减轻 β -磷酸甘油诱导的VSMC钙化     

黄芪皂苷在大鼠血管钙化中作用及可能机制

摘要 目的：在大鼠血管钙化模型上用黄芪皂苷注射液腹腔注射观察对血管钙化的影响,并探讨黄芪皂苷在血管钙化中作用及可能机制。方法：采用维生素D3和尼古丁制备大鼠血管钙化模型;运用von Kossa染色、原子吸收测定钙含量及碱性磷酸酶(ALP)活性测定判断血管钙化程度;用生物化学方法测定血管一氧化氮、超氧化物歧化酶和丙二醛含量;原位缺口末端标记法检测血管平滑肌细胞凋亡。结果：VDN处理组大鼠血管von Kossa染色见平滑肌细胞内和细胞间基质有大量棕黑色颗粒聚集;主动脉钙含量和ALP活性分别较对照高3.6和1.7倍(P<0.01),血管钙化后可加重血管组织氧化性损伤,增加血管平滑肌细胞凋亡;而诱导钙化后注射黄芪皂苷明显改善上述指标,减轻血管钙化程度和组织氧化损伤,平滑肌细胞凋亡细胞数量明显减少。结论：黄芪皂苷主要通过抑制血管平滑肌细胞氧化应激和细胞凋亡而减轻血管钙化。     

二甲双胍对糖基化终产物诱导血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

目的:在细胞水平观察二甲双胍对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导的血管平滑肌细胞钙化的抑制作用。方法:应用大鼠血管平滑肌细胞株(A7R5)进行体外实验,分别设对照组、牛血清白蛋白(BSA)组、AGE-BSA组、二甲双胍与AGE-BSA共干预组。将200 mg.L-1 AGE-BSA与不同浓度(10-4、5×10-5、10-5 mol.L-1)的二甲双胍在含10 mmol.L-1β-甘油磷酸的钙化培养液中共培养血管平滑肌细胞,观察不同浓度二甲双胍对血管平滑肌细胞钙化的影响。采用全自动生化分析仪测定细胞层钙含量,磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA表达,Western blotting检测BMP-2蛋白表达。结果:与对照组相比较,AGE-BSA组细胞层钙含量增加,碱性磷酸酶活性升高,细胞BMP-2 mRNA表达升高,BMP-2蛋白表达增加(P<0.01);不同浓度二甲双胍与AGE-BSA共干预可降低AGEs诱导的上述指标升高。结论:AGE-BSA可促进血管平滑肌细胞钙化,二甲双胍可剂量依赖性地抑制AGE-BSA诱导的钙化促进作用。     

钙化血管细胞凋亡基因的变化

目的：观察钙化血管细胞凋亡的现象和细胞凋亡基因的表达，以认识细胞凋亡在血管钙化发病中的意义。方法：利用维生素D3(Vitamin D3)和尼古丁（nicotine）制备大鼠血管钙化模型，检测血管钙含量、碱性磷酸酶（ALP）活性、^45Ca摄入和血管骨钙素含量；应用原位缺口末端标记（TUNEL）、免疫组织化学及DNA Ladder方法检测钙化血管的凋亡情况；应用免疫组织化学方法和^3H-TdR参入方法观察钙化血管的增殖情况。结果：血管的钙含量、ALP活性、^45Ca摄取、骨钙素含量均显著增高。钙化血管中存在凋亡细胞，表现为细胞缩小、核浓缩、核碎裂等。TUNEL结果显示，钙化血管的凋亡指数比正常组高36％，且Caspase-3和Bax的表达明显增强；Bcl-2的表达亦高于正常组；而NF-κB基因表达比正常组低26％。钙化组可见清晰的DNA阶梯状条带，正常组则未出现。钙化组主动脉平滑肌细胞的增殖指数较正常组增加，^3H-TdR参入量增加了2.5倍。结论：钙化血管细胞的凋亡及增殖基因的表达均增强。     

大鼠在体钙化心血管和离体钙化平滑肌细胞模型的制备

目的:应用药理学方法建立在体大鼠的心血管钙化模型和体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型.方法:每日8时给予大鼠肌注维生素D3(300 000 U/kg体重)和尼古丁(25 mg/kg体重,混入花生油2 mL中) 灌胃,18时再灌胃1次.对照组动物肌注生理盐水和单纯花生油灌胃,方法同钙化组.两组动物以相同饲料饲养4周后进行心功能指标检测.取动脉血检测钙含量,并摘取心脏和主动脉血管称重,用von Kossa 染色方法检测钙沉积.培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞用β-磷酸甘油丙酮酸钠处理,培养14天后收集,检测钙含量并用von Kossa 染色方法检测钙沉积.结果:维生素D3和尼古丁诱导的心血管组织钙化大鼠(VDN组大鼠)体重比对照组轻(P＜0.01),左心室重与体重比值高(P＜0.01),血浆钙水平差异无统计学意义(P＞0.05),但心肌和主动脉钙含量均高于对照组(P＜0.01);心肌和主动脉碱性磷酸酶活性也高于对照组(P＜0.05和P＜0.01);VDN组大鼠von Kossa染色见心脏血管组织有大量钙盐的沉积.VDN大鼠平均动脉压(MBP)、心率(HR)和左心室舒张末期压(LVEDP)并无明显变化(P＞0.05),左心室内压变化速率即 LVdp/dtmax和-LVdp/dtmax均较对照组低(P＜0.05和P＜0.01).体外培养诱导钙化VSMC与对照相比较,钙化VSMC用von Kossa染色见有大量棕黑色颗粒沉积,钙化VSMC的钙含量、45Ca2 摄入及碱性磷酸酶活性均增加(P＜0.01).结论:用药理学方法于在体和离体水平均可以建立简便、经济、可靠、稳定、重现性好的钙化模型.     

慢性肾脏病3-5D期患者血镁浓度与腹主动脉钙化的关系

目的 探讨慢性肾脏病(CKD)患者血镁浓度与腹主动脉钙化(AAC)之间的关系及干预钙化的措施.方法 选取CKD3-5D期患者共67例,收集患者临床资料,根据是否检出AAC分为钙化组和无钙化组,比较两组间指标差异,分析AAC的高危因素.结果 15例有AAC(22. 4％) ,52例无 AAC(77. 6％);钙化组年龄、血钙浓度、血磷浓度、钙磷乘积高于无钙化组(P<0.05),钙化组血镁水平低于无钙化组(2. 2 ± 0. 2 vs 2. 4 ±0. 4) mg/dl(P<0. 05);性别、体质量、血清白蛋白、碱性磷酸酶、全段甲状旁腺素(iPTH)、25羟维生素D、胆固醇和三酰甘油两组间均未见明显差异;二分类逻辑回归分析结果显示:年龄、血磷浓度、血镁浓度和钙磷乘积均为AAC独立的影响因素,血镁经过年龄、性别、磷、钙磷乘积和iPTH校正后差异有统计学意义(OR=0. 072,95％ CI: 0.006 ～0. 836 mg/dl,P=0. 035).结论 高龄、高磷及高钙磷乘积患者易发生AAC,低镁是除年龄、血磷和钙磷乘积外 AAC独立危险因素,提高体内血镁浓度可能有利于延缓 AAC进展.     

内质网应激在高糖所致血管平滑肌细胞钙化中的作用与机制

目的：探讨内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激在高糖引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化中的作用与机制。方法35 mmol/L D-葡萄糖(高糖)处理 VSMCs,模拟糖尿病状态,观察高糖能否引起 VSMCs 的 ER 应激和 VSMCs 表型转化(收缩型转变为成骨样细胞),观察 ER 应激的抑制剂对VSMCs 钙化的效应,采用比色法、o-cresolphthalein 法和 western blot 观察碱性磷酸酶活性、钙沉积和骨分化转录因子(Runx2)等指标。结果应用35 mmol/L D-葡萄糖分别处理 VSMCs 3 d 或7 d,可引起 VSMCs 的 ER 应激蛋白表达上调、碱性磷酸酶活性增加、钙沉积和骨分化标志蛋白增多;苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)预处理在抑制 VSMCs 的 ER 应激的同时,能阻断高糖所致 VSMCs 钙化(表现为碱性磷酸酶活性、钙沉积和骨分化标志蛋白下降)。结论高糖能激活 VSMCs 的 ER 应激,继而引起 VSMCs 凋亡和钙化,提示 ER 应激在高糖引起的VSMCs 钙化中起着重要作用。