光气对小鼠肺上皮细胞和内皮细胞凋亡的诱导作用

目的 研究光气对肺水肿小鼠肺上皮细胞和内皮细胞凋亡的诱导作用。方法 将32只BALB/C小鼠随机分成正常对照组(16只)和染毒组(16只)2组。正常对照组小鼠以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9mg/L剂量的光气,时间为5min。染毒后4h,取小鼠分离、培养肺Ⅱ型细胞用于电镜观察和流式细胞仪检测细胞凋亡,取小鼠肺脏进行DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL染色检测肺组织凋亡。结果 光气染毒肺水肿小鼠电镜下原代肺Ⅱ型细胞出现凋亡小体;流式细胞术显示肺Ⅱ型细胞凋亡率(40.26±7.74)显著高于正常对照组(1.58±1.01,P<0.001);DNA琼脂糖凝胶电泳出现"DNA梯状改变";TUNEL染色检测到肺上皮细胞和血管内皮细胞凋亡。结论 光气染毒可造成肺水肿小鼠肺脏细胞发生凋亡,提示光气造成小鼠肺水肿的发生机制存在细胞凋亡的诱导作用。     

分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型细胞中水通道蛋白-4的表达

目的 观察经分离纯化的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-4(AQP4)的表达。方法 对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,经过特殊染色及电镜鉴定,用免疫细胞化学及免疫电镜方法检测水通道蛋白-4在该单细胞上的表达。结果 大鼠肺泡Ⅱ型细胞免疫细胞化学水通道蛋白-4呈强阳性,免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。结论 水通道蛋白-4存在于分离的大鼠肺泡II型细胞膜上,对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

人胚肺发育不同阶段表面活性物质相关蛋白-D的表达及意义

目的 观察肺表面活性物质相关蛋白-D(SP-D)在人胚胎肺发育成熟过程中表达的特征。方法 取11~36周人胎肺组织常规石蜡包埋切片,HE染色观察胚肺各个发育阶段的成熟度,免疫组化检测SP-D时相性表达特征。结果 人胚胎发育至12周肺组织开始表达SP-D,定位于胚肺支气管上皮和肺泡Ⅱ型细胞(AEC II)胞质内,在胚肺发育小管期和囊泡期逐渐表达增强;开始由支气管近端逐渐向肺泡Ⅱ型细胞迁移。肺发育末期至出生后,SP-D均在AEC II中稳定表达。结论 SP-D随着胎肺发育成熟,表达逐渐增强,阳性细胞开始出现于胚肺支气管上皮细胞,逐渐定位于肺泡Ⅱ型细胞。     

三氧化二砷对小鼠B16细胞p53、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的 探讨三氧化二砷(As₂O₃))对小鼠B16细胞的生长抑制作用,对p53、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响,为临床治疗恶性黑素瘤提供理论和实验依据。方法 将不同剂量的As₂O₃作用于小鼠B16细胞后,吉姆萨染色和荧光染色观察B16细胞的凋亡变化;Western blot检测p53、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果 染色后镜下可见As₂O₃可致B16细胞出现凋亡现象; As₂O₃能诱导p53、Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达(P＜0.01)。结论 As₂O₃能诱导B16细胞凋亡,这一现象可能是通过诱导B16细胞的p53、Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下降来实现。     

L-型钙通道α1亚单位在成年鼠海马神经元上的差异性表达

目的 观察L-型钙通道不同的α1亚单位在成年鼠海马不同亚区神经元中表达的变化。方法 运用免疫组织化学染色方法特异性地标记脑型L-型L-型钙通道不同的α1亚单位CaV1.2α1C和CaV1.3α1D。结果 CaV1.2α1C主要分布在CA1区锥体细胞突起部分及CA3区锥体细胞的胞体区、基树突和远端顶树突;CaV1.3α1D则主要集中分布在海马各亚区的胞体区和近端突起;此外,CaV1.2α1C和CaV1.3α1D在细胞局部的分布特性上亦明显不同,前者主要呈现簇状分布,而后者则呈均匀分布。结论 L-型钙通道CaV1.2α1C和CaV1.3α1D亚单位在成年鼠海马不同亚区神经元中呈现差异性表达。     

脑源性神经营养因子在小鼠肠黏膜屏障中的作用

目的 运用基因敲除小鼠模型探讨脑源性神经营养因子(BDNF)在小鼠肠上皮屏障的作用。 方法 取BDNF^+/+小鼠与BDNF^+/-小鼠回肠及结肠黏膜,用透射电镜观察肠黏膜上皮的超微结构。免疫组织化学检测紧密连接蛋白ZO-1与occludin在结肠黏膜表达的变化,免疫印迹测定紧密连接蛋白claudin-1与claudin-2在结肠黏膜表达的差异。 结果 与BDNF^+/+小鼠相比,BDNF^+/-小鼠电镜下回肠上皮未见明显异常,结肠上皮屏障破坏,表现为微绒毛缺失、细胞间隙增宽以及细菌入侵;BDNF^+/-小鼠结肠上皮细胞紧密连接蛋白occludin、ZO-1以及claudin-1表达下调,而claudin-2表达上调。 结论 BDNF可能在小鼠结肠上皮屏障功能的发挥中起到调控作用。     

电压门控性钠离子通道β1 亚基条件性过表达转基因小鼠的制备

目的 制备电压门控性钠离子通道β1亚基基因(SCN1b)条件性过表达转基因小鼠.方法 将电压门控性钠离子通道β1亚基的编码序列片段插入表达载体pCMV-loxp-lacZ-stop-loxp-IRES-eGFP中;应用显微注射法将构建好的目的载体注入供卵小鼠受精卵核中,移植受精卵入假孕雌鼠输卵管;经PCR检测阳性的后代小鼠即为原代小鼠,通过后代小鼠X-gal染色鉴定目的基因在原代小鼠的整合部位. 结果 共获得13只仔鼠,其中3只为目的基因表达阳性的原代小鼠,其中1只原代小鼠的背根神经节(DRG)细胞X-gal染色呈阳性. 结论 成功制备在DRG条件性过表达SCN1b的转基因小鼠模型,为深入研究电压门控性钠离子通道β1亚基在痛觉调控中的功能提供了工具鼠.     

大鼠前庭上皮钠通道的表达

目的研究大鼠前庭组织中上皮钠通道α、β、γ亚基的表达及其意义。方法用兔抗大鼠上皮钠通道α、β和γ亚基的多克隆抗体,采用免疫组化SP法观察大鼠半规管、椭圆囊及球囊组织中α、β、y-ENαC的表达模式。结果在大鼠前庭组织中,α、β、γ亚基较一致地分布于椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴的上皮细胞胞膜和基质细胞,而α亚基在壶腹嵴基质细胞的表达稍弱。结论ENαC的各个亚基分布于前庭的各个区域,形成功能性通道参与内耳内淋巴的调节,从而保持内耳内环境的稳定。     

通过渗透微泵稳定抑制小鼠血浆CD26/DPPIV分子酶活性的研究

目的 研究采用皮下植入渗透微泵给予西他列汀对小鼠体内CD26/DDPIV蛋白酶活性的作用效果与持续时间。方法 将灌注西他列汀药物的渗透泵经手术植入BL6/C57小鼠皮下，通过高效液相色谱-质谱监测小鼠体内血液药物浓度，酶标法检测小鼠血浆DPPIV蛋白酶活性，流式细胞术观察小鼠脾T细胞CD26分子的表达，利用Transwell小室检测小鼠T细胞迁移能力。取渗透泵周围皮肤，病理切片检查小鼠皮下病理损害或炎性反应。结果 B6/C57小鼠在植入渗透泵后，体内药物浓度比采用直接皮下注射法稳定，持续时间久，血浆DPPIV蛋白酶活性抑制程度与血药浓度明显相关。给药24 h后，小鼠脾T细胞CD26分子表达无明显变化，渗透泵组迁移能力较对照组明显降低。皮下植入渗透泵小鼠组饮食活动度无明显改变，皮肤病理检查未见炎性反应与病理损害。结论 通过渗透泵给予小鼠药物能够保持西他列汀血药浓度稳定，持续抑制体内DPPIV活性，降低T细胞迁移能力，为CD26/DPPIV分子功能与免疫体内研究提供更方便有效的途径。     

人胎肺发育不同阶段端粒酶逆转录酶的表达及意义

目的 检测端粒酶逆转录酶(hTERT)在人胎肺发育不同阶段的表达特征,探讨其在胎肺上皮干细胞发育、分化过程中的作用及意义。方法 对孕妇自愿捐献的胎龄为10~34周的引产胎儿肺组织,用免疫组织化学技术检测hTERT的表达。结果 胎龄10周的肺组织即检测到hTERT的表达,主要表达于正在分支的支气管原始上皮细胞浆内。随着胎肺发育,阳性表达的细胞逐渐向远端呼吸道迁移。到发育晚期,呼吸道上皮hTERT表达较前逐渐减弱,强阳性表达的细胞仅集中在细支气管的基底膜和少数新生肺泡内,在形态上类似基底细胞和Ⅱ型肺泡细胞。结论 在人胎肺发育中hTERT的表达可能是肺上皮干细胞或祖细胞维系其未分化状态和自我更新能力的重要标志;对保证支气管上皮和肺泡上皮细胞持续正常分化和再生,维持上皮组织的完整性起着重要的作用。     

L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏中的表达

目的 研究L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏中的空间表达情况。方法制备成年大鼠心脏冰冻切片，结合大体位置和HE染色结果快速辨认出窦房结、房室结和结后延伸，采用免疫荧光和免疫印迹技术检测L型钙通道α1C亚单位在大鼠窦房结、房室结、结后延伸、右房、右室的表达，用共聚焦显微镜观察其表达部位，通过凝胶成像及图像分析系统对实验结果进行分析。结果荧光呈现点状、斑状或不规则的短线状，主要分布于细胞膜及细胞内的膜性结构，其荧光强度由弱到强依次为窦房结、房室结、结后延伸、右心房、右心室，房室结和结后延伸之间无显著性差异（P〉0．05），其余两两相比均有显著差异（P〈0．05），其中右心房、有心室明显强于窦房结、房室结和结后延伸（P〈0．01）。各部位在相对分子质量200000左右可见一特异性蛋白条带。对蛋白条带进行灰度值分析，结果与免疫荧光相一致。结论L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏分布广泛，在不同部位表达量不同，在工作肌组织的表达量明显高于传导组织．提示钙电流在心脏不同部位有不同的分子基础.     

L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏中的表达

目的 研究L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏中的空间表达情况。方法 制备成年大鼠心脏冰冻切片,结合大体位置和HE染色结果快速辨认出窦房结、房室结和结后延伸。采用免疫荧光和免疫印迹技术检测L型钙通道α1C亚单位在大鼠窦房结、房室结、结后延伸、右房、右室的表达,用共聚焦显微镜观察其表达部位,通过凝胶成像及图像分析系统对实验结果进行分析。结果 荧光呈现点状、斑状或不规则的短线状,主要分布于细胞膜及细胞内的膜性结构,其荧光强度由弱到强依次为窦房结、房室结、结后延伸、右心房、右心室,房室结和结后延伸之间无显著性差异(P>0.05),其余两两相比均有显著差异(P<0.05),其中右心房、右心室明显强于窦房结、房室结和结后延伸(P<0.01)。各部位在相对分子质量200000左右可见一特异性蛋白条带。对蛋白条带进行灰度值分析,结果与免疫荧光相一致。结论 L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏分布广泛,在不同部位表达量不同,在工作肌组织的表达量明显高于传导组织,提示钙电流在心脏不同部位有不同的分子基础。     

L-型钙通道α1亚单位在成年鼠海马神经元上的差异性表达

目的观察L-型钙通道不同的α1亚单位在成年鼠海马不同亚区神经元中表达的变化.方法运用免疫组织化学染色方法特异性地标记脑型L-型L-型钙通道不同的α1亚单位CaV1.2α1C和CaV1.3α1D.结果CaV1.2α1C主要分布在CA1区锥体细胞突起部分及CA3区锥体细胞的胞体区、基树突和远端顶树突;CaV1.3α1D则主要集中分布在海马各亚区的胞体区和近端突起;此外,CaV1.2α1C和CaV1.3α1D在细胞局部的分布特性上亦明显不同,前者主要呈现簇状分布,而后者则呈均匀分布.结论L-型钙通道CaV1.2α1C和CaV1.3α1D亚单位在成年鼠海马不同亚区神经元中呈现差异性表达.     

C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及Myosin Ⅵ的表达

目的探讨C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ在该过程中的表达。方法选择从E10到E20每个时间点的孕鼠,取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、HE染色及免疫荧光观察小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ抗体标记阳性毛细胞出现的时间。结果小鼠内耳前庭末梢器官发育早、过程短,E10是听囊,E11已经能区分出背侧较大的前庭囊和腹侧较小的耳蜗囊,E12的前庭囊和耳蜗囊区分已很明显,并且出现内淋巴囊和管、上和后半规管始基,E13可见到上和后半规管壶腹嵴始基,出现水平半规管始基和椭圆囊始基,E14形成球囊和水平半规管壶腹嵴始基,E15椭圆囊、球囊、膜半规管初具成熟形态,所有囊斑、壶腹嵴基本形成,E18形态发育基本完成。MyosinⅥ标记阳性表达的毛细胞在E15的所有壶腹嵴、囊斑里出现,未见支持细胞表达MyosinⅥ。结论 MyosinⅥ在E15开始表达,这个时期可能是毛细胞成熟的关键时期。     

次乌头碱对心肌细胞Ca2+调控蛋白mRNA表达的影响

目的 考察次乌头碱(HA)对原代培养乳大鼠心肌细胞L-钙通道、钙调蛋白(CaM)、肌质网雷诺定受体(RyR2)mRNA表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用RT-PCR法测定L-钙通道α1C亚基、CaM及RyR2 mRNA的表达.结果 HA作用15 min时,60、120 μΜ/L能提高心肌细胞膜L-钙α1C ...     

HBV转基因小鼠与C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养的比较研究

目的 比较研究乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠和C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养体系.方法 采用贴壁培养法建立HBV转基因小鼠和C57BL/6小鼠BMSCs分离培养体系,通过在培养液中添加不同浓度的血清进行培养,分析HBV转基因小鼠和C57BL/6小鼠BMSCs细胞形态和数量的差异.结果 C57BL/6小鼠原代BMSCs生长迅速,按1∶3传代后呈漩涡状生长,形态类似成纤维细胞.HBV转基因小鼠原代BMSCs生长缓慢;以1∶2传代后生长缓慢,有明显的血清依赖性及密度依赖性.结论 在相同的生长环境下,不同血清浓度的培养液中,HBV转基因小鼠BMSCs生长较正常C57BL/6小鼠的BMSCs生长明显缓慢.     

辛伐他汀防治心肌细胞肥大效应及其与钙通道关系的研究

目的：探讨辛伐他汀对心肌细胞肥大的防治作用及其与钙通道活动的关系。方法：采用血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大模型。应用改良Lowry法测定心肌细胞总蛋白含量。相差显微镜测定心肌细胞表面积。CCK-8法检测心肌细胞活力变化。westernblot方法检测心肌细胞L-型钙通道亚单位Cav1.2（α1C）、T-型钙通道亚单位Cav3.1（α1G）、Cav3.2（α1H）蛋白表达的变化。应用激光共聚焦显微镜技术检测[Ca^2＋]i的变化。结果：（1）辛伐他汀能明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞总蛋白含量及细胞表面积的增加,同时提高心肌细胞活力;（2）辛伐他汀能明显降低心肌细胞T-型钙通道α1G、α1H蛋白表达,但对L-型钙通道α1C蛋白表达无明显影响;（3）辛伐他汀可呈剂量依赖性抑制心肌细胞肥大所致的钙离子超载。结论：辛伐他汀对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大具有明显的防治作用,其作用机制可能与辛伐他汀抑制T-型钙通道α1G、α1H蛋白的重新再表达有关,并与其抑制细胞内钙超载密切相关。     

血管紧张素转化酶2对肝细胞凋亡的影响

目的 探讨血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2,ACE 2）对肝细胞凋亡的影响及可能机制。方法 1利用ACE2过表达DNA载体转染人肝细胞株HepG2细胞;2MTT[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide]法检测过表达ACE2基因的HepG2细胞在棕榈酸（palmitate,PA）处理下的细胞活力;3原位DNA末端酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL）检测同周龄雄性C57BL/6和ACE2基因敲除（ACE2^-/y）小鼠肝细胞凋亡情况;4实时荧光定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）法检测凋亡相关基因的表达;5蛋白质印迹法（Western blot）检测B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（anti-apoptotic protein B cell lymphoma-2,Bcl-2）、促凋亡基因（Bcl-2 associated X protein,Bax）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）、C-Jun氨基末端激酶（C-Jun NH2-terminal kinase,JNK）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase3）蛋白水平的表达情况。结果 1以不同浓度PA处理HepG2细胞24 h后表现为细胞活力的降低,而过表达ACE2基因组细胞活力明显高于绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）组（PA浓度为0.4、0.8、1.0 mmol/L时,P<0.05）;2同周龄雄性ACE2^-/y小鼠肝脏细胞TUNEL阳性细胞明显多于对照组C57BL/6小鼠;3ACE2过表达显著降低了凋亡相关蛋白Bax,caspase-3,CHOP,磷酸化JNK的表达,而抗凋亡基因Bcl-2表达升高。与此同时,ACE2过表达也明显降低了内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）相关细胞凋亡通路基因的表达。结论 ACE2减少了肝细胞的凋亡,其机制可能与ACE2对肝脏内质网应激的保护作用有关。     

内淋巴囊减压联合三个半规管填塞术对难治性梅尼埃病的眩晕疗效分析

目的 探讨内淋巴囊减压联合三个半规管填塞术治疗难治性梅尼埃病眩晕症状的疗效,术后对平衡能力及生活质量的影响。方法 选择26例难治性梅尼埃病患者,完成内淋巴囊减压联合三个半规管填塞术,记录患者手术前后眩晕控制情况、平衡能力、听力情况、眩晕残障程度(Dizziness Handicap Inventory,DHI)评分、耳鸣障碍量表(Tinnitus Handicap Inventory,THI)评分和耳鸣痛苦程度分级,分析手术效果。结果 26例患者术后眩晕明显改善,眩晕完全控制率为88.46%,有效率为100%。术后出现平衡不稳感,平均(5.08±4.52)个月好转,均无跌倒风险。术后眼震发生率69.23%,平均(5.00±2.67)d症状消失。通过Burg评分和视觉模拟量表评分发现,随着术后时间延长,患者平衡能力逐渐恢复,DHI评分表明随术后时间延长,患者生活质量逐渐好转,在术后6个月时趋于稳定。此外,与术前相比,26例患者术后6个月的平均听力阈值略有升高,但差异无统计学意义;术后6个月的耳鸣THI量表评分和耳鸣痛苦程度分级均下降。结论 内淋巴囊减压联合三个半规管填塞术对眩晕控制效果好,患者术后生活质量明显提高,受影响的主观平衡能力约5个月后恢复正常。