分泌功能性白细胞介素2的重组卡介苗促进脾细胞产生γ干扰素

作者通过大肠杆菌-卡介苗(BCG)穿梭质粒pMV261将鼠白细胞介素2(IL-2)基因引入BCG细胞中,并通过加入BCGa抗原信号序列使表达的IL-2分泌到细胞外.重组BCG与鼠脾细胞共同培养,明显地刺激脾细胞分泌γ干扰素.在试验中,作者构建了两组质粒:一组在质粒pMV261上插入小鼠IL-2基因;另一组在质粒pMV261上插入大鼠IL-2基因.为使表达产物分泌到细胞外及区分BCG产生的重组IL-2与哺乳动物细胞产生的IL-2,在每组重组质粒IL-2基因前加入BCGα抗原信号序列或/和流感病毒血凝素表位标记序列.所有新构建质粒都使用 BCG HSP60启动子进行表达.     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的：探讨治疗性双质粒HBV DNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法：以脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000介导，将带有preS2＋S基因的重组疫苗质粒pS2，S和带有hIL2＋hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞，同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组，于转染后24，48，72，96h采用EL／SA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素（IL-2）及干扰素（IFN-1）的表达，并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性，采用ECL Western blotting分析和鉴定目的蛋白preS2＋S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果：双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达。且48h时目的蛋白的表达量达峰值，其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性，pS2．S和pFP的转染上清分别在30．6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论：HBVDNA疫苗质粒pS2．S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h，并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30．6ku和110ku。     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

乙型肝炎病毒及其抗原诱导肝癌细胞HepG2表达IL-8研究

目的 研究HBV及其抗原成分是否诱导HepG₂细胞表达IL-8及其相关机制。方法 以人肝胚瘤细胞株HepG₂和HepG₂.2.15细胞为研究对象,比较分析两种细胞株细胞上清液中IL-8的表达,并将能够表达完整HBV病毒颗粒或HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBx蛋白的质粒pSM2、pHBs-EGFP、pHBe-EGFP、pHBc-EGFP和pHBx-EGFP转染HepG₂细胞,以ELISA技术分析细胞上清液的IL-8表达情况。在转染pSM2、pHBx-EGFP质粒的HepG₂细胞中加入核转录因子NF-κB抑制剂SN50,以凝胶阻滞电泳和ELISA技术分析细胞中核转录因子NF-κB活性和细胞上清液中IL-8含量。结果 HepG₂.2.15细胞上清液中IL-8显著高于HepG₂细胞;转染HBV全基因组序列表达质粒pSM2和HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBx蛋白的质粒pSM2、pHBs-EGFP、pHBe-EGFP、pHBc-EGFP、pHBx-EGFP后,HepG₂细胞能够表达完整的HBV颗粒或HBV抗原,其中转染质粒pSM2和pHBx-EGFP的HepG₂细胞上清液中IL-8的含量显著高于空载体质粒pcDNA3.1和pEGFP-N1转染的HepG₂细胞。EMSA分析提示随着NF-κB抑制剂SN50抑制HepG₂细胞中NF-κB的活性,转染质粒pSM2和pHBx-EGFP的HepG₂细胞上清液中IL-8的含量逐渐减少。结论 在体外细胞模型中,HBV及其抗原成分很可能通过影响细胞核转录因子NF-κB活性进而诱导肝细胞表达IL-8。     

DC-SIGN的配体对肺结核患者树突状细胞黏附BCG水平的影响

目的 探讨DC-SIGN的配体脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)对肺结核患者树突状细胞黏附BCG水平的影响.方法 构建带有EGFP基因的分枝杆菌穿梭质粒,电转化BCG,热诱导绿色荧光蛋白的表达,从而标记BCG;分离结核患者外周血单个核细胞,以GM-CSF和IL-4诱导树突状细胞生长,培养第5天用流式细胞术检测其表面DC-SIGN表达率,并在与不同浓度ManLAM预孵育后,与标记BCG结合,测定两者的黏附率.结果 (1)分枝杆菌穿梭质粒构建成功,命名为pHSP70-EGFP.(2)用绿色荧光蛋白标记BCG成功.(3)肺结核患者外周血树突状细胞表面DC-SIGN表达率为(86.69±3.66)%.(4)伴随着ManLAM浓度的不断增加,肺结核患者外周血树突状细胞和BCG的黏附率不断下降.结论 (1)可以用穿梭质粒pHSP70-EGFP在BCG中表达绿色荧光蛋白,从而标记BCG.(2)DC-SIGN分子是肺结核患者外周血树突状细胞表面结核分枝杆菌的重要受体.(3)纯化的ManLAM可以阻断肺结核患者外周血树突状细胞与BCG的黏附.     

基因重组卡介苗高效电转化条件的实验研究

目的探讨卡介苗(BCG)电转化中影响转化效率的因素。方法利用电转化仪将穿梭质粒pYL-hB7-2转入BCG中,考察其影响因素并优化转化条件。转化子利用卡那霉素抗性筛选和聚合酶链反应(PCR)及酶链免疫吸附试验(ELISA)鉴定。结果重组BCG获得较高的转化效率,最高可达8/9。外加电场强度和质粒浓度是决定电转化效率的关键因素,感受态细胞的状态,如生长期和冰浴时间均可影响转化效率。结论成功解决了基因重组BCG构建过程中电转化的问题。     

胎盘TLR3分布及与HBV宫内感染的关系初探

目的:了解Toll样受体(TLR)3在外周血HBsAg阳性母亲胎盘组织中的表达及分布,探讨其与HBV宫内感染的关系.方法:采用SABC免疫组织化学方法结合显微镜观察胎盘组织HBsAg和TLR3的表达和分布,以胎盘各层细胞出现棕黄色颗粒判断为阳性;Abbott化学发光法检测新生儿外周血HBsAg;ELISA法检测母亲外周血HBsAg和HBeAg.结果:24例母亲外周血HBsAg均阳性,除2例因胎盘组织脱落不计外,22例中17例胎盘组织中HBsAg呈阳性.6例新生儿发生HBV宫内感染,宫内感染率25%(6/24),胎盘HBV感染率77.27%(17/22). HBsAg分布于蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞.17例HBsAg阳性的胎盘组织中16例TLR3阳性,阳性细胞较少,主要在滋养层细胞和绒毛间质细胞.1例宫内感染的新生儿、HBsAg阴性的胎盘组织5例中的4例、外周血HBsAg阴性的6例正常胎盘组织切片上及空白对照均未检测到TLR3阳性表达.结论:外周血中HBV对TLR3可能仅有微弱的激活作用.     

血清HBsAg与HBVDNA定量关系分析

目的定量检测血清乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）浓度与乙型肝炎病毒DNA（HBVDNA）,并探讨两者的相关关系及临床应用价值。方法随机选取HBsAg阳性的患者135例,采用化学发光法（CLIA）定量检测其血清中HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）,同时采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测其血清中HBVDNA载量。结果 135例患者中HBeAg阳性的61例,HBVDNA阳性的87例,其HBsAg和HBeAg浓度值与HBVDNA载量的相关系数（r）分别为：0.583（P〈0.01）、0.550（P〈0.01）,HBsAg与HBeAg的r值为：0.699（P〈0.01）。结论血清HBsAg浓度与HBVDNA载量及HBeAg浓度均成高度正相关,可较好的反应HBV的复制水平,便于临床开展应用。     

HMGN2重组表达质粒的构建及其抗乙型病毒性肝炎的病毒活性

目的：构建HMGN2重组表达载体并观察高迁移率蛋白HMGN2分子的抗乙型病毒性肝炎的病毒作用。方法用基因克隆的方法,构建pET -32 a-c （＋）-HMGN2重组表达质粒;用亲和层析的方法,纯化His-HMGN2融合蛋白, Tricine-SDS-PAGE电泳、Western blotting对纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。以HBV DNA转染的细胞株HepG2.2.15细胞为模型,用ELISA检测HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA的含量。结果成功构建了pET-32a-c（＋）-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,降低HBV DNA拷贝数。结论 HMGN2在体外细胞培养中有直接抗HBV的活性。     

分泌人共刺激分子B7-2的重组卡介苗的构建及表达与鉴定

目的构建分泌表达人共刺激分子B7-2（hB7-2）的重组卡介苗（rBCG）。方法采用聚合酶链反应（PCR）以含hB7-2的质粒为模板扩增出hB7-2活性序列,利用基因重组技术插入pYL-MCS质粒构建出分泌型卡介苗穿梭表达载体pYL—hB7-2。用电穿孔方法将该质粒转入卡介苗得到rBCG,利用PCR扩增和测序检测其hB7-2的DNA表达,分别SDS-PAGE和ELISA法测定rBCG上清液中和菌内hB7-2蛋白。结果酶切鉴定、PCR扩增和DNA测序均表明rBCG含有的hB7-2DNA与文献结果一致,SDS—PAGE检测出有相应蛋白表达,ELISA法测定rBCG上清液中分泌的B7-2蛋白为3．8U／ml。结论构建的重组BCG可以分泌表达人共刺激分子hB7-2,能够提供激活免疫反应的共刺激信号,将会成为膀胱肿瘤免疫治疗的一种新型方法。     

甲型H5N1禽流感病毒血凝素在sf9昆虫细胞中的表达及其鉴定

目的  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达甲型H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）并对其进行鉴定。方法  根据sf9昆虫细胞密码子偏好性,对A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）禽流感病毒的HA基因进行序列优化并全长合成。构建重组供体质粒pFastHA,经PCR及测序鉴定后,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒BacmidHA,用M13引物进行PCR鉴定。采用脂质体法转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBacHA。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）、蛋白质印迹法以及间接免疫荧光法对rBacHA表达产物进行分析。结果  供体质粒pFastHA经双酶切后产生了1条与预期大小相符的1 707 bp条带,序列测定证实目的基因无突变。穿梭质粒BacmidHA经PCR扩增,得到1条与预期大小相符的3 180 bp条带。SDS-PAGE结果显示,rBacHA表达产物的相对分子质量约为65 000。蛋白质印迹法分析表明,表达产物能与禽流感病毒阳性血清结合。在荧光显微镜下,感染rBacHA的sf9细胞呈现绿色荧光,提示HA基因得到表达。结论  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功制备了具有良好抗原性的重组HA蛋白。     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达重组鼠白细胞介素(IL)-2蛋白。方法:用Flag标记鼠IL-2并加入真核细胞启动子CMV,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒,收获重组杆状病毒,将构建病毒转导BHK细胞培养,用Western blot检测IL-2蛋白。结果:通过杆状病毒表达系统,在BHK细胞成功表达重组的鼠IL-2蛋白。结论:重组杆状病毒在真核细胞中成功表达重组鼠IL-2蛋白。     

Esat6-卡介苗重组疫苗的构建免疫原性及抗结核作用的初步研究

目的构建结核分枝杆菌esat6-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗。方法通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原esat6的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,采用电穿孔技术导入卡介苗中,应用聚合酶链反应(PCR)扩增、聚丙烯酰胺凝胺电泳(PAGE)鉴定重组卡介苗。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测其血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数。通过观察esat6-卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防试验中实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标评价esat6-卡介苗重组疫苗对结核分枝杆菌感染的预防效果。结果PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定、PAGE电泳表明成功地构建了esat6基因pYUB295重组质粒,ESAT6蛋白在卡介苗中分泌表达。重组卡介苗免疫原性试验表明:esat6-卡介苗重组疫苗组有ESAT6特异性抗体产生,45d时达到最高水平。脾淋巴细胞增殖试验表明各组刺激指数均达2.0以上,esat6重组卡介苗免疫组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数稍高于对照组。预防试验表明:esat6-卡介苗重组疫苗组、卡介苗组与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月内的死亡率。其中esat6-卡介苗重组疫苗组效果显著,与卡介苗组比有显著差异。结核分支杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,小鼠脏器大体病变及脏器培养结果表明:esat6-卡介苗重组疫苗免疫组小鼠比其他各组小鼠结核菌的负荷轻。抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验各组结果差异无统计学意义。结论正确构建了esat6-卡介苗重组疫苗,esat6-卡介苗重组疫苗能提高卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防作用。     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。     

含hIL-24重组腺病毒载体(Ad-mda-7/hIL-24)的构建及其对喉癌细胞Hep2增殖的影响

目的构建含有人白细胞介素24(hIL-24)的腺病毒表达载体(Ad-mda-7/hIL-24),观察其对喉癌细胞Hep2增殖的影响。方法提取IL-24cDNA克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,采用pAdEasy系统进行细菌内同源重组得到含目的基因的腺病毒载体,脂质体转染293A细胞进行包装并扩增病毒。PCR和Western blot方法鉴定重组腺病毒,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对Hep2增殖的影响。结果成功构建Ad-mda-7/hIL-24,滴度达107pfu/mL,MTT检测表明Ad-mda-7/hIL-24可明显抑制Hep2细胞生长。结论构建有较强感染能力的Ad-mda-7/hIL-24,并能显著抑制Hep2细胞增殖,为研究其作用机制及将其用于喉癌的基因治疗提供了实验和理论依据。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6的构建和鉴定

目的构建含人/鼠嵌合粘附分子CD44拼接变异体6(chimeric human and mouse CD44 splice variant 6,h/mCD44v6)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,并进行表达。方法通过PCR扩增h/mCD44v6的全基因cDNA,将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcD-NA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1(+)-h/mCD44v6,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6细胞株中h/mCD44v6全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出h/mCD44v6的cD-NA全长基因,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6。结论成功克隆和构建了h/mCD44v6的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,为进一步研究h/mCD44v6的新功能和免疫治疗奠定了基础。