KCNH6基因肝脏特异性敲除小鼠的构建及其初步应用

目的 构建KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠,并监测其肝脏血脂变化。方法 运用Cas9技术构建KCNH6^flox/flox转基因小鼠,将其与肝脏细胞特异性表达Cre重组酶工具鼠（Alb-cre）进行杂交,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法鉴定基因型。监测基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体质量和进食量。分别检测8周和20周雌雄各两组小鼠的三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。结果 成功构建KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠,其基因型为KCNH6^flox/flox/Cre^T。与同窝对照组相比,基因敲除小鼠的体质量和进食量均无明显变化。8周雄性和雌性小鼠的血脂无明显变化。20周时雄性小鼠的胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇均有明显升高。结论 成功构建了KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠动物模型,成年雄性小鼠存在肝脏血脂代谢异常。动物模型的构建为探讨KCNH6基因在肝脏脂代谢中的作用提供重要研究平台。     

Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的 构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法 运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13^flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶（Ins2-cre）工具鼠进行杂交,采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定,并对该基因敲除（knock out,KO）小鼠及其同窝野生（wild type,WT）小鼠的体质量、糖耐量、胰岛素分泌水平进行测定。结果 成功构建胰岛β细胞特异性Unc13基因条件性敲除小鼠（以下简称为Unc13 KO鼠）。进一步研究显示Unc13 KO鼠与WT鼠相比,体质量无明显变化,但糖耐量受损,胰岛素第一时相分泌下降。结论 成功构建了Unc13基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型,为探讨Unc13基因在糖尿病发生、发展中的作用提供研究平台。     

应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法 根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果 获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论 成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。     

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

目的 繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法 将Lck-Cre小鼠与Spi1^flox/flox小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^flox/flox的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Westernblot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果 Lck-Cre×Spi1^flox/flox小鼠基因稳定遗传。与Spi1^flox/flox小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^flox/flox小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。     

ether-a-go-go相关基因通道在胰岛β-细胞中的作用

目的 探究ether-a-go-go相关基因（ether-a-go-go related gene,ERG）通道在胰岛β-细胞中的作用。方法 提取野生型（wild type,WT）与ERG基因敲除型（knockout,KO）小鼠胰岛β-细胞,利用全细胞膜片钳技术记录钾离子电流与动作电位,分析敲除ERG基因后钾电流与动作电位的变化。对两组小鼠进行腹腔注射葡萄糖耐量实验,分析基因敲除后小鼠糖耐量的变化,探究ERG基因是否对体内血糖浓度有影响。结果 在两组小鼠胰岛β-细胞中记录到的钾离子电流均呈现内向整流趋势,KO组钾离子电流明显减小,动作电位时程明显延长。动物实验中,KO组小鼠糖刺激2 h后血糖浓度较WT组显著降低。结论 ERG通道电流是胰岛β-细胞中钾离子电流的重要组成部分,可显著影响动作电位时程,进而影响体内血糖浓度。     

GPIHBP1基因敲除小鼠在严重高三酰甘油血症急性胰腺炎导致肺损伤研究中的应用

目的 旨在通过基因修饰的高三酰甘油血症小鼠建立急性胰腺炎模型,观察胰腺与肺病理改变。方法 采用野生小鼠与糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1（glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1,GPIHBP1）基因敲除小鼠,腹腔注射雨蛙素,诱导急性胰腺炎,检测血浆脂质与不同时间下淀粉酶活性,观察胰腺与肺组织病理形态改变。结果 GPIHBP1基因敲除小鼠的血浆三酰甘油极度升高,在诱导急性胰腺炎后,淀粉酶活性明显改变,胰腺病理损伤加重,同时伴有肺损伤病变,肺泡灌洗液细胞数目明显增加。结论 GPIHBP1基因敲除小鼠诱导急性胰腺炎后,胰腺与肺病理损伤明显加重,对进一步探讨高脂血症急性胰腺炎导致肺损伤及远隔器官损伤的发病机制具有一定的意义。     

肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠模型的构建

目的 运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^Δhep)小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法 将loxP标记的Sirt3^flox/flox小鼠与Alb-Cre纯合子(Alb-Cre^+/+)小鼠进行交配,F1代Sirt3^flox/-/Alb-Cre^+/-小鼠再与Sirt3^flox/flox小鼠进行交配并鉴定,F2代基因型为Sirt3^flox/flox/Alb-Cre^+/-的小鼠即为本实验所构建的Sirt3^Δhep小鼠,Sirt3^flox/flox/Alb-Cre^-/-小鼠即为对照小鼠Sirt3^flox/flox小鼠。提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观...     

Odaph对牙釉质发育影响的初步研究

目的 利用Runx2条件性敲除小鼠的转基因动物模型初步研究Odaph对牙釉质发育的影响。方法 PCR鉴定转基因小鼠的基因型,实时定量PCR实验方法检测Runx2loxp/loxp鼠和K14-cre-Runx2loxp/loxp基因敲除小鼠下颌磨牙区中Amelx,Ambn,Enam,Amtn,Odam,Scpppq1及Odaph基因mRNA的相对表达含量的改变,最后用免疫组化技术检测Runx2及Odaph在基因敲除小鼠下颌磨牙区的表达情况。结果 实时荧光定量PCR结果显示:与野生型小鼠相比,在出生后10 d基因敲除小鼠中Amelx,Ambn,Enam基因mRNA的相对表达量均上调,Amtn,Odam,Scpppq1及Odaph的表达显著下降;免疫组化染色结果显示:Anti-Runx2在出生后10 d敲除型小鼠成釉细胞胞核中呈阴性表达,Anti-Odaph在出生后10 d野生型小鼠成釉细胞远端呈强阳性表达,然而在敲除型小鼠中表达不明显。结论 Odaph在牙釉质发育过程中具有重要作用。     

脑源性神经营养因子在小鼠肠黏膜屏障中的作用

目的 运用基因敲除小鼠模型探讨脑源性神经营养因子(BDNF)在小鼠肠上皮屏障的作用。 方法 取BDNF^+/+小鼠与BDNF^+/-小鼠回肠及结肠黏膜,用透射电镜观察肠黏膜上皮的超微结构。免疫组织化学检测紧密连接蛋白ZO-1与occludin在结肠黏膜表达的变化,免疫印迹测定紧密连接蛋白claudin-1与claudin-2在结肠黏膜表达的差异。 结果 与BDNF^+/+小鼠相比,BDNF^+/-小鼠电镜下回肠上皮未见明显异常,结肠上皮屏障破坏,表现为微绒毛缺失、细胞间隙增宽以及细菌入侵;BDNF^+/-小鼠结肠上皮细胞紧密连接蛋白occludin、ZO-1以及claudin-1表达下调,而claudin-2表达上调。 结论 BDNF可能在小鼠结肠上皮屏障功能的发挥中起到调控作用。     

KLHL15基因对雄性小鼠睾丸和肝脏的影响

目的 探讨KLHL15基因缺失对雄性小鼠睾丸、肝脏组织结构和功能的影响。方法 比较野生型(WT)和KLHL15敲除型(KLHL15^-/^-)雄性小鼠的睾丸、肝脏组织在结构和功能上的差异,测定指标包括：(1)生育能力：子代生育数、精子活力及精子质量;(2)解剖学：比较生长情况相近的野生型、KLHL15^-/^-雄性小鼠睾丸、肝脏质量及脏器系数;(3)病理组织学：通过HE观察KLHL15基因缺失对小鼠肝脏、睾丸结构的影响;(4)肝功能：原位末端标记法(Tunel)检测肝脏组织细胞凋亡情况;基于串联质量标签(TMT)标记定量蛋白组学分析方法对肝脏差异蛋白进行富集分析。结果 (1)生育能力：与WT雄性小鼠比较,KLHL15^-/^-雄性小鼠精子总数减少,不运动精子(IM)数量增加,精子测定参数平均曲线运动速度(VCL)、平均路径速度VAP降低(P=0.010,P=0.020);(2)解剖学：与WT小鼠比较,KLHL15^-/^-小鼠肝...     

Kcnh6点突变单基因糖尿病家系的小鼠模型构建及表型分析

目的 通过CRISPR/Cas9技术构建Kcnh6基因P235L位点基因敲入定点突变小鼠模型,并验证该突变能否成功复制人类糖尿病家系表型,为接下来研究Kcnh6基因在糖尿病发病中的作用提供更精确的实验工具。方法 设计针对已知糖尿病家系点突变位点的sgRNA(small guide RNA,sgRNA),同时制作一个携带靶位点同源臂、突变位点序列的供体DNA敲入载体。将sgRNA、cas9 mRNA和敲入载体通过显微注射移入小鼠的受精卵,选取其中存活的受精卵将其移植入假孕小鼠子宫,繁育得到子代小鼠。采用聚合酶链反应和基因测序等方法检测子代小鼠Kcnh6基因碱基突变情况。监测基因敲入小鼠的体质量和并对小鼠做糖耐量和胰岛素分泌实验。结果 成功构建Kcnh6-P235L位点基因敲入纯合子小鼠。在高脂饲料喂养条件下,与同窝野生型(wild type, WT)小鼠相比,Kcnh6 基因插入(knock in, KI)点突变小鼠的体质量增加,糖耐量及胰岛素分泌功能受损。结论 成功构建了Kcnh6基因点突变敲入小鼠模型,且此模型具有糖尿病相关表型。     

超声二维斑点追踪技术分析小鼠颈动脉僵硬度的方法学研究

目的 探讨超高分辨率小动物超声影像系统二维斑点追踪技术分析小鼠颈动脉血管壁僵硬度的方法。方法 选用6只正常8周龄C57B1 /6J雄性小鼠及6只60周龄载脂蛋白E（apolipoprotein E）基因敲除小鼠（ApoE^－/－）,应用超高分辨率小动物专用超声影像系统及50 MHz探头,测定小鼠颈动脉内膜及中膜厚度（intima-media thickness,IMT）、血管平均面积、血管平均直径及面积变化率和直径变化率、血管扩张性等指标,同时测量血管壁整体径向应变及脉搏波传导速度（pulse wave velocity,PWV）,以此评价小鼠颈动脉血管壁僵硬度。结果 与正常小鼠相比,ApoE^－/－小鼠IMT增加［（0.05±0.01）mm vs（0.02±0.01）mm］,面积变化率［（49.64±5.69）% vs（34.33±5.92）%］和直径变化率［（25.21±3.04）% vs（17.33±3.14%）］下降;血管扩张性降低［（100.49±12.40）MPa^－1 vs（59.87±21.22）MPa^－1］,脉搏波传导速度增快［（1.90±0.37）m/s vs（3.09±0.23）m/s］;血管壁整体径向应变降低［（66.97±10.28）% vs（41.64±8.51）%］,差异有统计学意义（n=6, P<0.05）。结论 应用二维斑点追踪技术分析小鼠颈动脉血管壁运动僵硬度的方法是可行的,可为小动物血管僵硬度检测提供新的方法。     

27-羟基胆固醇与胆固醇对裸鼠食管鳞癌和人食管癌细胞增殖的影响

目的 旨在探讨胆固醇和27-羟基胆固醇对食管鳞癌增殖、侵袭和迁移能力的生物学行为及对细胞因子MCP-1分泌的影响。 方法 动物体内实验:通过建立裸鼠食管鳞癌动物模型,给予高胆固醇饮食(高胆固醇饮食组,n=4)和正常饮食(对照组,n=4),观察胆固醇在体内对食管鳞癌肿瘤生长的影响,第5周实验终止时,对两组瘤体体积进行测量并计算抑瘤率。细胞实验:观察胆固醇(浓度分别为0、0.123、0.148、0.185、0.269、0.370 mg/mL)和27-羟基胆固醇(浓度分别为0、1、5、10、20 μmol/mL)对正常食管鳞癌细胞(ECA109)和基因cyp27a1、cyp7b1敲除后的ECA109细胞增殖能力的影响,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同药物浓度干预下细胞的增殖活性。采用划痕实验和侵袭实验(胆固醇0.185 mg/mL,27-羟基胆固醇1 μmol/mL)检测肿瘤细胞的侵袭效应。利用慢病毒转染敲除27-羟基胆固醇的上游基因cyp27a1和下游基因cyp7b1,重复上述实验,探讨27-羟基胆固醇合成或代谢基因敲除对ECA109细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并通过ELISA实验检测基因敲除后对肿瘤细胞单核细胞趋化因子-1(MCP-1)分泌的影响。两组不同时间瘤体体积和CCK-8吸光度值采用两因素方差分析,交互作用有统计学意义时进一步行简单效应分析。多组间数据均值差异比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用LSD法。 结果 动物实验结果表明:裸鼠异种移植肿瘤体积在高胆固醇饮食组与对照组分别为(5.055±0.774)cm³和(1.866±0.618)cm³,抑瘤率为-170.79%,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞实验结果表明:(1)胆固醇可以促进ECA109细胞和上游基因cyp27a1敲除后的ECA109细胞增殖,胆固醇低浓度下促进上游基因cyp27a1敲除后的ECA109细胞增殖(P均<0.05);27-羟基胆固醇可以抑制ECA109细胞增殖,但促进下游基因cyp7b1敲除后的ECA109细胞增殖(P均<0.05);(2)胆固醇和27-羟基胆固醇对于ECA109细胞迁移能力无影响(F=2.418,P=0.170),27-羟基胆固醇的上游基因cyp27a1和下游基因cyp7b1敲除对ECA109细胞迁移能力无影响(F=0.602,P=0.578);(3)基因敲除后细胞与对照组相比,细胞侵袭能力发生改变(F=3.992,P=0.047),其中下游基因cyp7b1敲除后,侵袭能力受到抑制(P<0.05);上游基因cyp27a1敲除对ECA109细胞侵袭能力无影响(P>0.05);(4)与正常ECA109细胞相比(151.883±2.948),基因敲除可以使肿瘤细胞MCP-1因子的分泌发生改变(F=553.538,P<0.001)。上游基因cyp27a1敲除后,细胞的MCP-1因子分泌增多(213.823±4.572),下游基因cyp7b1敲除后,细胞的MCP-1因子分泌减少(107.240±4.121)(P均<0.001)。 结论 胆固醇在体内外均可刺激ECA109细胞的增殖;27-羟基胆固醇抑制ECA109细胞增殖,胆固醇促进ECA109细胞的增殖,并且具有浓度依赖性;上游基因cyp27a1敲除可以增强胆固醇在低浓度下对细胞增殖能力的影响,但对细胞侵袭能力无影响;下游基因cyp7b1敲除可以改变27-羟基胆固醇对细胞增殖活性的影响,并抑制细胞的侵袭能力;27-羟基胆固醇上游基因cyp27a1敲除可促进细胞MCP-1因子的分泌,下游基因cyp7b1敲除抑制MCP-1因子的分泌。     

敲除Sirt3后激活自噬对阿尔茨海默病有保护作用

目的: 探究Sirt3在阿尔茨海默病（AD）发生发展中的作用及可能机制。方法: 体内实验以C57BL/6野生型小鼠和Sirt3基因敲除小鼠为对象,采用腹腔注射D-半乳糖联合脑定位注射β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-40建立AD小鼠模型。莫里斯（Morris）水迷宫实验、自发活动开场实验和悬尾实验观察造模前后小鼠学习记忆和焦虑抑郁状态的改变,免疫荧光染色观察脑内海马区域Aβ沉积情况,蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中自噬和凋亡相关蛋白表达。体外实验选小鼠皮层原代细胞作为对象,给予Aβ_1-40建立AD体外模型,MTT法检测细胞活性。结果: 体内实验结果显示,野生型小鼠诱发AD后平台潜伏期延长（P < 0.05）,穿越平台次数减少、目标象限停留时间缩短（均P < 0.05）,提示造模后小鼠的学习记忆能力下降;而Sirt3敲除能够缓解AD所致的学习记忆障碍（均P < 0.05）。相较于野生型小鼠,Sirt3基因敲除小鼠脑内海马区域的Aβ沉积减少（P < 0.05）,凋亡蛋白cleaved caspase 3表达减少（P < 0.05）。另外,野生型小鼠诱发AD后LC3-Ⅱ和P62蛋白表达增加（均P < 0.05）,提示自噬流受阻;而Sirt3基因敲除小鼠诱发AD后LC3-Ⅱ蛋白表达增加,P62蛋白表达减少（均P < 0.05）,提示自噬被激活。小鼠皮层原代细胞AD模型中,Sirt3基因敲除的细胞较野生型细胞死亡减少（P < 0.05）;加用自噬抑制剂氯喹后,Sirt3基因敲除的保护作用消失（P < 0.05）。结论: Sirt3敲除对于D-半乳糖联合Aβ_1-40诱发的AD有保护作用,这种保护作用可能与自噬流活化有关。